CD47在糖尿病大鼠模型肾损害中的作用探讨

艾 娜，谢席胜，龙琼先，王彦江，夏梦迪

(1. 泸州医学院，四川 泸州 646000；2. 川北医学院第二临床学院/南充市中心医院，四川 南充 637000)

CD47在糖尿病大鼠模型肾损害中的作用探讨

艾 娜1,2，谢席胜2，龙琼先2，王彦江2，夏梦迪1,2

(1. 泸州医学院，四川 泸州 646000；2. 川北医学院第二临床学院/南充市中心医院，四川 南充 637000)

目的 观察CD47在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病(DM)大鼠模型肾脏中的表达情况，初步探讨CD47与DM肾损害的关系及其作用。方法 将成年雄性SD大鼠80只随机分为正常对照组15只和DM组65只。采用STZ 50 mg/kg单次腹腔注射建立DM大鼠模型。监测各组大鼠空腹血糖(FBG)、尿蛋白(UP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)；分别于2，4，8周处死各组大鼠，通过糖原染色(PAS)观察各组大鼠肾脏的病理改变，免疫组化观察CD47在各组大鼠肾脏的分布情况；分别对UP、Cr、BUN、肾脏病理损害、CD47蛋白表达进行相关性分析。结果 PAS染色可见DM组大鼠肾小球系膜基质增生，肾小球可见分叶现象等典型的糖尿病肾病损伤变化。与正常对照组相比，DM组大鼠的FBG、Cr、BUN、UP水平及CD47蛋白表达均明显增加，并且随着DM病程的延长而继续增加。DM组大鼠CD47的积分光密度与Cr、BUN、UP、肾小球硬化评分呈正相关。结论 持续高血糖通过诱导DM大鼠肾小球CD47的高表达，引起细胞基质增生，参与DM大鼠肾脏的损伤和肾脏病变的进展。

糖尿病肾损害；肾小球硬化；CD47；高血糖；蛋白尿

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常见的慢性并发症之一，也是导致终末期肾病的一个主要原因。CD47也被称为整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，在正常肾脏系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞均有表达，参与调节基质蛋白的黏附、细胞凋亡、增殖、迁移和存活[1-2]。但其在肾脏病理生理中的具体作用还不清楚。Hafdi等[1]研究发现DKD患者肾组织CD47的表达均低于肿瘤患者正常肾组织的表达，而与正常人肾组织比较的研究尚少见。在DM病程不同阶段，CD47在肾小球的表达变化及其与肾脏损害的关系方面的研究亦暂无报道。本研究通过免疫组化方法检测CD47在DM大鼠不同阶段肾脏中的表达及分布情况，初步探讨CD47蛋白的表达及在DKD中的作用。

1 实验资料

1.1实验动物及材料 清洁级雄性SD大鼠80只，8周龄，体质量(220±20)g，购自川北医学院实验动物中心，生产许可证号为SCXK(川)2008-1B。链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美国)；三诺安稳血糖仪以及三诺安稳血糖试纸(长沙三诺生物公司)；尿素氨(BUN)、肌酐(Cr)检测试剂盒(上海科华生物公司)。兔抗大鼠CD47抗体(博士德生物公司)；兔SP免疫组化染色试剂盒(北京中杉)；DAB显色试剂盒(博士德生物公司)。Backman全自动生化分析仪。

1.2动物分组及造模 大鼠按随机数字表分为正常对照组15只及DM组65只。造模前禁食12 h，按50 mg/kg[3]一次性腹腔注射STZ，STZ以0.1 mmol/L、pH 4.5枸橼-枸橼酸钠缓冲液配制成1%的溶液，30 min内使用。正常对照组注射等量的枸橼酸盐缓冲液。1周后尾静脉取血测血糖，连续3 d≥16.7 mmol/L，且尿糖()定为DM大鼠，成模率80%，未成功的予以剔除。随机选取DM组45只成模大鼠按完全随机方法分为DM2周组、DM4周组和DM 8周组，每组15只。

1.3生化和病理检查 分别于成模后2周、4周、8周禁食8 h采空腹血测空腹血糖，然后处死大鼠。处死前放入代谢笼内留24 h尿液，检测尿蛋白定量。心脏采血测定血Cr、BUN。取出肾脏固定于10%中性甲醛固定，包埋，常规切片。PAS染色后光镜观察肾组织病理改变。小球硬化程度以PAS染色的小球面积占该小球总面积百分比计算。半定量评分标准参考文献[4]方法：0分为无硬化，1分为1%～25%，2分为25%～50%，3分为50%～75%，4分为75%～100%。评分标准：取PAS染色切片，400倍镜下每片随机选取20个正切的肾小球，计算其均值，作为该标本的肾小球硬化指数。

1.4肾组织免疫组化检查 按照SP免疫组织化学染色试剂盒步骤进行。石蜡切片，烤片2 h，常规脱蜡至水，高温高压修复，滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶。加封闭用正常山羊血清37 ℃孵育30 min，加兔抗大鼠CD47多克隆抗体(1∶200)4 ℃过夜孵育，以PBS代替一抗做替代对照，并按抗体说明设相应的阳性组织对照。加生物素标记山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min。加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。每步都用pH 7.2的磷酸盐缓冲液反复冲洗。DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。细胞中存在棕黄色颗粒表示CD47的阳性着色部位。采用Image Pro Plus 6.0软件对各组切片进行定量分析，每张切片随机选取4个400倍高倍镜视野，分别测定每个视野肾小管CD47阳性染色平均积分光密度值(integral optical density，IOD)。

2 结 果

2.1造模情况 DM组喂养过程中死亡9只，4周组死亡3只，8周组死亡6只。正常对照组大鼠精神状态良好，活动自如，反应灵敏，毛色光滑；DM组大鼠日渐消瘦，体毛凌乱、发黄，失去光泽，出现易饥、多饮、多尿表现，尿中泡沫增多，部分出现视力下降等并发症。

2.2各组大鼠空腹血糖(FBG)、Cr、BUN、UP检测情况 成模后各组大鼠FBG、Cr、BUN、UP均高于正常对照组(P均<0.05)。DM组不同周数组间BUN、Cr、UP比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

2.3各组肾组织病理情况及评分比较 PAS染色显示，正常对照组肾小球结构基本正常，肾小球系膜区PAS阳性物质无明显增多，系膜细胞无明显增生，见图1；DM组肾小球肥大，系膜基质增多，系膜区PAS阳性物质呈不均匀红染，部分可见成团块状聚积，见图2～4。正常对照组(n=15)、DM 2周组(n=15)、DM 4周组(n=12)、DM 8周组(n=9)肾小球硬化评分分别为(0.41±0.49)分、(0.97±0.50)分、(2.63±0.72)分、(3.56±0.63)分。DM组评分均明显高于正常对照组(P均<0.05)，DM组组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

表1 各组大鼠FBG、Cr、BUN、UP结果比较

注：①与正常对照组相比，P<0.05；②DM 2周组比较，P<0.05；③与DM 4周组比较，P<0.05。

2.4各组肾组织CD47的表达情况 正常大鼠肾组织无或少量CD47表达，见图5；DM早期可见肾小球内CD47表达增多，到DM8周时CD47大量表达，见图6～8。正常对照组积分光密度(IOD)值为0.947 3±0.030 1，DM 2周组为2.325 1±0.393 2，DM 4周组为3.504 1±0.437 3，DM 8周组为6.711 7±0.512 3，DM各组IOD值均明显高于正常对照组(P均<0.05)，DM组组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

图1 正常对照组肾组织PAS染色表现(×400)

图2 DM 2周组肾组织PAS染色表现(×400)

图3 DM 4周组肾组织PAS染色表现(×400)

图4 DM 8周组肾组织PAS染色表现(×400)

图5 正常对照组肾脏CD47免疫组化染色(×400)

2.5相关性分析 CD47 IOD值与FBG(r=0.592，P<0.05)、Cr(r=0.939，P<0.05)、BUN(r=0.859，P<0.05)、UP(r=0.975，P<0.05)、肾小球硬化评分(r=0.950，P<0.05)成正相关；肾小球硬化评分与Cr(r=0.957，P<0.05)、BUN(r=0.866，P<0.05)、UP(r=0.963，P<0.05)呈正相关。

图6 DM 2周组肾脏CD47免疫组化染色(×400)

图7 DM 4周组肾脏CD47免疫组化染色(×400)

图8 DM 8周组肾脏CD47免疫组化染色(×400)

3 讨 论

本研究通过建立DM大鼠模型，动态观察肾功能及肾脏病理变化以及肾脏组织CD47的表达变化情况，结果显示成模大鼠血糖升高，且持续处于较高水平，说明造模成功，这与既往关于DM大鼠模型的研究结果一致[5]。PAS染色显示，成模大鼠肾小球局部基质增生，随着DM病程的延长，基质增生更明显，DM 8周时肾小球基质重度弥漫性增生，小球呈分叶状，部分大鼠可见典型的K-W结节，通过肾小球硬化评分也证实在DM 8周时已出现明显的肾小球硬化。随着DM病程的延长，DM组大鼠24 h尿蛋白定量不断升高，Cr、BUN进行性升高，说明持续高血糖状态引起大鼠肾脏损害，肾功能异常，这与文献[6]研究结果一致。

CD47在多种细胞中广泛表达，可参与调节细胞外基质蛋白的黏附[1]。本研究结果表明，DM组大鼠肾脏中CD47表达的IOD值明显升高，说明持续高血糖状态诱导了DM大鼠肾脏CD47表达增加。Hafdi等[1]的研究发现，与肿瘤患者正常肾组织中CD47的表达量相比，在肾小球疾病时，CD47表达是下降的，这与本结果不一致。有研究表明，CD47与自身免疫性糖尿病的发生密切相关[7]。另有研究发现高糖可以诱导血管平滑肌细胞CD47表达增多[8]。因此，在DM导致的肾小球病变中，可能CD47的表达不同于原发性肾小球疾病。CD47在DM大鼠肾脏高表达的现象值得进一步探讨。

本研究通过相关性分析发现，DM组大鼠CD47表达的IOD值与FPG、Cr、BUN、UP水平呈正相关，说明CD47在DM肾脏的表达与DM肾功能的异常直接相关。通过对DM大鼠肾小球硬化评分发现，随着血糖长期、持续升高，DM肾小球硬化更加明显。相关性分析发现CD47的表达与肾小球硬化呈正相关。因此，推测持续高血糖通过诱导肾脏CD47的表达，引起细胞基质增生，从而参与DM肾脏病理及功能的损害及病变的发展。但CD47通过何种分子信号机制参与糖尿病患者肾脏的损伤有待进一步的研究。

[1] Hafdi Z,Lesavre P,Nejjari M,et al. Distribution of alphavbeta3, alphavbeta5 integrins and the integrin associated protein-IAP(CD47) in humanglomerular diseases[J]. Cell Adhes Commun，2000，7(6):441-451

[2] Pettersen RD. CD47 and death signaling in the immunesystem[J]. Apoptosis,2000,5(4):299-306

[3] Lomas-Soria C,Ramos-Gómez M,Guevara-Olvera L,et al. Trans-criptomic analysis in diabetic nephropathy of streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Int J Mol Sci，2011,12(12):8431-8448

[4] Nangaku M,Miyata T,Sada T,et al. Anti-hypertensive agents inhibit in vivo the formation of advanced glycation end products and improve renaldamage in a type 2 diabetic nephropathy rat model[J]. J Am Soc Nephrol，2003,14(5):1212-1222

[5] Nekooeian AA,Eftekhari MH,Adibi S,et al. Effects of pomegranate seed oil on insulin release in rats with type 2 diabetes[J]. Iran J Med Sci，2014,39(2):130-135

[6] Gao C,Aqie K,Zhu J,et al. MG132 ameliorates kidney lesions by inhibiting the degradation of smad7 in streptozotocin-induced diabetic nephropathy[J]. J Diabetes Res，2014,2014:918396

[7] Dugas V,Beauchamp C,Chabot-Roy G,et al. Implication of the C-D47 pathway in autoimmune diabetes[J]. J Autoimmun,2010,35(1):23-32

[8] Maile LA,Capps BE,Miller EC,et al. Integrin-associated protein a-ssociation with SRC homology 2 domain containing tyrosine phosphatase substrate 1 regulates igf-I signaling in vivo[J]. Diabetes,2008,57(10):2637-2643

Discussion of the effect of CD47 in the diabetic rat model of renal damage

AI Na1,2, XIE Xisheng2, LONG Qiongxian2, WANG Yanjiang2, XIA Mengdi1,2

(1. Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan, China; 2.The Second Clinical Medical College of Chuanbei Medical College/Nanchong Central HosPital, Nanchong 637000, Sichuan, China)

Objective It is to observe the expression of CD47 in the kidney of diabetes (DM) rat model induced by streptozotocin (STZ) and to discuss its role and the relationship with DM kidney injury. Methods A total of 80 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (n=15) and DM group(n=65). DM group were treated with an intraperitoneal injection dose (50 mg/kg) of STZ to establish the model of DM. The level of fasting blood glucose(FBG), urine protein(UP), creatinine (Cr) and blood urinary protein (BUN) were monitored in each group；the rats in each group were sacrificed at 2, 4 and 8 weeks respectively to observe the pathological changes of kidney by periodic acid-schiff stain, the expression of CD47 in the rat kidney by immunohistochemical. The correlation between UP, Cr, BUN, renal pathological damage and CD47 protein expression were analyzed. Results Periodic acid-schiff stain showed mesangial and matrix proliferation in DM rats, some typical damage characteristics of diabetic nephropathy could be found in glomerular include leaf phenomenon, K-W nodules. Compared with normal control group, FBG, UP, creatinine, urea nitrogen and the expression of CD47 was significantly increased in DM rats(P<0.05), and with the progress of DM continue to increase. The integrated optical density (IOD) of CD47 were positively correlated with Cr, BUN, UP and the grade of glomerular sclerosis. Conclusion Sustained hyperglycemia can induce the expression of CD47 in glomerulus in DM rats, cause cell matrix hyperplasia, may participate in DM rat kidney damage and the progress of kidney disease.

diabetic nephropathy; glomerular sclerosis; CD47; hyperglycemia; proteinuria

艾娜，女，硕士研究生，从事肾病内科临床工作。

谢席胜，E-mail：xishengx@163.com

四川省卫生厅资助项目(2009-258；130463)；四川省教育厅资助项目(12ZA059)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.02.003

R-332

A

1008-8849(2015)02-0122-04

2014-06-25