抗水通道蛋白-4抗体应用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的鉴别诊断价值

连淑芬

(上海德济医院检验科 200331)



·论 著·

抗水通道蛋白-4抗体应用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的鉴别诊断价值

连淑芬

(上海德济医院检验科 200331)

目的 探讨血清抗水通道蛋白-4(AQP-4)抗体应用于多发性硬化和视神经脊髓炎患者疾病诊断的临床意义。方法 选择2013年3月至2014年10月该院收治的74例多发性硬化以及视神经脊髓炎患者,回顾性分析其临床资料,对血清中AQP-4抗体水平进行检查。结果 视神经脊髓炎疾病患者各类型的阳性率分别为视神经炎(ON)51.89%、长节段横贯性脊髓炎(LETM)68.42%、视神经脊髓型多发性硬化(OSMS)57.14%、视神经脊髓炎(NMO)81.25%;而传统型多发性硬化(CMS)患者的AQP-4抗体检测为阴性。视神经脊髓炎疾病谱的患者脊髓受累均大于3个椎体节段；多发性硬化脊髓受累均小于3个节段。视神经脊髓炎多为急性或亚急性起病,多见于中年女性,发病年龄平均(42.1±13.9)岁,与CMS比较，差异无统计学意义(P>0.05)。AQP-4抗体对于视神经脊髓炎敏感性为81.25%,特异性为100.00%。结论 AQP-4抗体可以作为视神经脊髓炎疾病以及多发性硬化鉴别诊断的重要指标。

视神经脊髓炎； 多发性硬化； 水通道蛋白-4

视神经脊髓炎(NMO)主要累及视神经及脊髓中枢神经系统，是一种炎性脱髓鞘病变，我国的发病率相比于欧美人群更高。大部分人认为NMO属于多发性硬化(MS)的亚型，但是自从发现NMO的特性自身抗体及靶抗水通道蛋白4(APQ-4)后，才逐渐意识到两种疾病的发病机制不同。NMO疾病谱包括了伴随其纵向扩展的横贯性脊髓炎(LETM)、视神经脊髓型多发性硬化(OSMS),视神经炎(ON)[1-2]。本研究旨在探讨AQP-4抗体对NMO疾病谱疾病以及MS疾病的鉴别诊断价值，为临床上AQP-4抗体检测的开展提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年3月至2014年10月本院神经内科收治的中枢神经系统脱髓鞘疾病患者74例,所有患者的诊断均依据MeDonald的相关诊断标准[3]或Wingerchuek中有关于视神经脊髓炎的相关诊断标准[4]。本研究经医院伦理委员会批准审核，随访方式为门诊或电话方式。NMO患者的诊断需满足以下条件：(1)OSMS；(2)无复发性视神经炎(RON)；(3)脊髓病变大于3个节段；(4)伴有其他自身免疫性疾病的视神经炎(ON)或是脊髓炎(TM)。MS患者排除NMO，符合2005年的MS诊断标准[5]，本研究74例患者中ON患者19例(ON组)，LETM患者19例(LETM组)，OSMS患者7例(OSMS组)，NMO患者16例(NMO组)，MS患者13例(MS组)，5组患者性别、发病年龄、复发次数、残疾状态扩展评分表(EDSS)评分等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 MS及NMO患者的临床资料对比

1.2 方法

1.2.1 数据库建立及标本收集 建立患者数据库及组织标本库,收集影像资料，血清学标本,血清标本置于-80 ℃条件下保存备用。

1.2.2 APQ-4抗体测定

1.2.2.1 仪器与试剂 低温高速离心机、Multiskan FC酶标仪(Thermo Scientific公司生产)，人AQP-4酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司)。

1.2.2.2 原理 采用双抗体夹心法测定标本中的人AQP-4水平。用纯化的AQP-4抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入AQP-4，再与HRP标记的AQP-4抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB染色。TMB在辣根过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的AQP-4呈正相关，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中AQP-4的浓度。

1.2.2.3 血清样本处理及要求 室温血液自然凝固10～20 min(2 000～3 000 r/min)，仔细收集上清于-20 ℃冷冻保存，但应避免反复冻融。保存过程中出现沉淀，应再次离心。

1.2.2.4 操作过程 (1)标准品的稀释与加样：每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。在酶标包被板上设标准孔10孔，稀释后各孔加样量都为50 μL,浓度分别为30、20、10、5、2.5 μg/L，重复2次。(2)加样：分别设空白孔及样品孔，样品孔加样品稀释液40 μL及10 μL样品，轻轻晃动混匀。(3)温育：用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。(4)洗涤：用配好的洗涤液重复洗涤5次，拍干。(5)加酶：每孔加入酶标试剂50 μL,空白孔除外。(6)温育：操作同步骤(3)。(7)洗涤：操作同步骤(4)。(8)显色：每孔加入显色剂A 50 μL,再加入显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃遮光显色15 min。(9)每孔加终止液50 μL,终止反应(此时蓝色立转为黄色)。(10)以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的OD值。测定应在加终止液后15 min内进行。

1.2.2.5 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；标准或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

2 结 果

2.1 各组抗体阳性率比较 在5组患者中,NMO组患者阳性率最高81.25%,其余依次为LETM组、ON组、OSMS组、CMS组,且CMS组与NMO组的AQP-4阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其余各组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。AQP-4抗体对于NMO的敏感性为81.25%,特异性为100.00%。见表2。

2.2 AQP-4抗体阳性与阴性疾病组影像学特点对比 AQP-4阳性患者脊髓MRI特点：AQP-4抗体阳性患者共出现34例出现脊髓异常,其中27例大于3个椎体节段病变,对称性以及横贯性受损,AQP-4抗体阴性患者脊髓受累情况小于3,且多为偏侧受损。

表2 各组患者AQP-4阳性率比较(n或%)

3 讨 论

中枢神经系统脱髓鞘性病变的主要症状为神经髓鞘的脱失，其中MS是一种发生于青年人群中的常见中枢神经系统白质脱髓鞘疾病,该病有着丰富的临床表现,具体根据其累及的中枢神经系统部位而呈现特异性表现,患病后患者可出现肢体无力，感觉异常，共济失调等症状[6]。

MRI影像学技术已被广泛用于两种疾病的诊断，但是MRI只能够分析病灶数量量性标准,无法对MS及其他类型的复发缓解性神经系统疾病进行区分,MS因其多变的临床表现,使其和其他中枢系统脱髓鞘性疾病很难鉴别。

Lennon等[7]2004年应用间接免疫荧光法检测了NMO患者的血清中存在着特异性抗体,他们将这种技术应用于NMO患者的抗体检测,敏感性为73%,特异性为91%,而MS患者血清的该抗体为阴性,Saiz等[8]也研究了NMO及MS患者血清NMO-IgG抗体水平,发现NMO-IgG敏感性达到了76%,特异性达到94%，所以NMO是一种独立疾病,但是二者的发病机制却是不同,该抗体检测可以对于NMO及MS予以鉴别，通过其进一步的研究发现NMO-IgG可以与脑内软脑膜以及微血管成分进行特异性结合,且AQP-4蛋白与小鼠脊髓胶质——液体界面的分布和NMO-IgG结合位点是相一致的[9]，所以AQP-4抗体可以作为NMO诊断的特异性诊断指标。

本研究结果发现，NMO疾病谱中各组患者的阳性率分别为NOM(81.25%)、LETM(68.42%)、ON(51.89%)、OSMS(57.14%),均较CMS组明显增高,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。Waters等[10]应用间接荧光免疫测定AQP-4的结果也证实了视神经脊髓炎的抗体阳性率达到了73%，多发性硬化为9%,与本研究的结果相似。

同时研究中发现：(1)多为急性起病；(2)常见于中年女性,平均(41.0±15.4)岁,与CMS组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；(3)患者可出现自身免疫病,如干燥综合征等；(4)典型的脊髓受累主要为颈髓,多在3个椎体节段以上受累,且呈横贯性,而MS组的脊髓受累则在3个椎体节段以下,呈非对称性分布。

综上所述,NMO是一类独立的疾病，AQP-4抗体检测技术可以作为其区别于别于MS的特异性指标。

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[3]Polman CH,Reingold SC,Edan G，et al.Diagnostic criteria for multiple sclerosis:2005 revisions to the “medonald criteria”[J].Ann Neurol,2005,58(6):840-846.

[4]Ingerehuk DM,Lennon VA,Pittock SJ,et al.The speetrum of neuromyelitis optiea[J].Laneet Neurol,2007,11(6):805-815.

[5]Polman CH，Reingold SC，Edan G，et al．Diagnostic criteria for multiple sclerosis：2005 revisions to the“McDonald Criteria”[J]．Ann Neur，2005，58(12)：840-846．

[6]刘伟,余英豪,郑智勇，等.中枢神经系统原发性脉管炎伴脱髓鞘病变报道并文献复习[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(3):323-325.

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[10]Weinshenker BG,Wingerehuk DM,Vukusie S,et al.Neuromyelitis optica IgG predicts relapse after longitudinally extensive transverse myelitis[J].Ann Neurol,2006,59(3):566-569.

Clinical value of application of AQP-4 antibody in differentiation diagnosis of central nervous system demyelination diseases

LIANShu-fen

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiDejiHospital,Shanghai200331,China)

Objective To explore the clinical significance of the application of serum aquaporin-4(AQP-4) antibody in the diagnosis of multiple sclerosis and neuromyelitis opica(NMO).Methods 74 cases of multiple sclerosis and NMO in this hospital from March 2013 to October 2014 were selected and their clinical data were retrospectively analyzed.The serum AQP-4 antibody was detected.Results The AQP-4 antibody positive rates of various types of NMO were 51.89% for optic neuritis(ON),68.42% for long segment transverse myelitis (LETM),57.14% for opticospinal multiple sclerosis (OSMS) and 81.25% for NMO;but the AQP-4 antibody detection in the conventional multiple sclerosis(CMS) was negative.(2)In the patients of NMO disease spectrum,the spinal cord was involved more than 3 vertebral segments;while in multiple sclerosis,the involved spinal cord was less than 3 segments.(3) NMO was mostly acute or subacute onset,more common in middle-aged women,the mean age at the onset was (42.1±13.9) years,the difference between NMO and CMS had no statistical difference(P>0.05).Conclusion AQP-4 antibody can be used as an important index of the differentiation diagnosis between NMO and multiple sclerosis.

neuromyelitis optica; multiple sclerosis; aquaporin-4

连淑芬，女，本科，主管检验师/主管输血技师，主要从事脑科检验方面工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.032

A

1672-9455(2015)14-2051-02

2015-03-25

2015-04-15)