白细胞介素-17诱导单核细胞分泌白细胞介素-10的初步机制研究

王行政

(重庆医科大学附属永川医院核医学科，重庆 402160)



·论 著·

白细胞介素-17诱导单核细胞分泌白细胞介素-10的初步机制研究

王行政

(重庆医科大学附属永川医院核医学科，重庆 402160)

目的 探讨白细胞介素-17(IL-17)诱导单核细胞分泌白细胞介素-10(IL-10)的分子机制。方法 收集该院体检中心健康者外周血，经淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞后，利用免疫磁珠分选技术纯化CD14阳性的单核细胞，然后在体外用IL-17进行刺激培养，或预先加入信号通路抑制剂孵育1 h后再进行刺激培养，酶联免疫吸附试验检测IL-10的水平。结果 CD14阳性的单核细胞经IL-17刺激后明显诱导IL-10的分泌(P<0.01)，且具有剂量和时间依赖性；加入核转录因子(NK-κB)抑制剂可明显抑制IL-17诱导单核细胞分泌IL-10的作用(P<0.05)，但MEK1/2抑制剂、p38/MAPK抑制剂和 JNK抑制剂则无明显抑制作用。结论 IL-17可能通过NK-κB信号途径诱导单核细胞上调IL-10的分泌，从而发挥免疫抑制作用。

白细胞介素-17； 白细胞介素-10； NK-κB信号

Th17细胞是新近发现的一群以表达白细胞介素-17(IL-17)为主要特征的CD4+T细胞，在多个疾病如感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤中起着重要作用[1-2]。早期的研究主要集中于Th17细胞的分化调控及其效应分子IL-17作用于上皮细胞后的下游信号[3]。但是最近发现IL-17受体(IL-17R)除了表达于上皮细胞，在外周血单核细胞和组织浸润巨噬细胞表面也组成性表达[4]，提示IL-17/IL-17R可影响单核细胞和巨噬细胞的功能。在炎症微环境中，巨噬细胞可产生大量的促炎因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)等介导炎症应答，但是为了防止导致炎症损伤，巨噬细胞也会产生抗炎因子如白细胞介素-10(IL-10)等进行负向调节[5]；在肿瘤微环境中，肿瘤浸润巨噬细胞也通过产生大量IL-10抑制抗肿瘤免疫细胞的功能，进而促进了肿瘤的不断进展[6]。本研究收集健康者外周血，将分离纯化得到的单核细胞在体外进行培养，探讨IL-17是否能够诱导单核细胞分泌IL-10，并进一步阐明其作用的分子机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集10例本院体检中心健康者外周血，其中男5例，女5例，年龄23～38岁。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂 重组人细胞因子IL-17购自美国Peprotech公司，淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；CD14+分选试剂盒和PE标记的抗人CD14抗体购自德国美天旎生物技术公司，NF-κB 抑制剂(BAY 11-7082)、MEK1/2抑制剂(U0126)、p38/MAPK抑制剂(SB203580)和 JNK抑制剂(SP600125)购自上海碧云天生物技术有限公司，红细胞裂解购自北京天根生化科技有限公司，IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自北京达科为公司。

1.2.2 方法 收集健康人外周血于本院免疫细胞培养室，利用淋巴细胞分离液将外周血中的单个核细胞分离，然后用德国美天旎生物技术公司的分选磁铁结合CD14+免疫磁珠分选试剂盒操作说明对单个核细胞中的CD14+单核细胞进行分选纯化，分离后的细胞利用PE标记的抗人CD14抗体染色30 min后进行流式细胞仪检测纯度；按照1×105细胞/孔加入到96孔板，设置三重复孔，加入不同浓度(1、10、100 ng/mL)的重组人细胞因子IL-17进行刺激，或预先加入浓度均为10 μmol/L的信号抑制剂：NF-κB抑制剂 (BAY 11-7082)、MEK1/2抑制剂 (U0126)、p38/MAPK抑制剂 (SB203580)和 JNK抑制剂 (SP600125)作用1 h，然后换取新的培养基后再加入IL-17(100 ng/mL)刺激24 h，收集培养上清液，ELISA检测IL-10的水平，每个实验利用3例健康者外周血进行重复。

2 结 果

2.1 单核细胞经IL-17刺激后培养上清液中IL-10水平的检测 首先，利用免疫磁珠分选技术将CD14+的单核细胞进行分离纯化，得到分选后的CD14+单核细胞纯度达90%以上(图1)，表明单核细胞可用于下一步试验。ELISA检测结果显示，单核细胞经重组细胞因子IL-17刺激后，刺激组单核细胞培养上清液中的IL-10水平明显高于未刺激组单核细胞，且这种效果以剂量和时间依赖的方式增加(图2)，表明IL-17可诱导单核细胞分泌免疫抑制性的细胞因子IL-10。

图1 外周血单个核细胞经CD14+免疫磁珠分选试剂盒分离纯化，然后流式细胞技术染色检测分选前后CD14+细胞占总细胞比例

注：A为不同浓度IL-17刺激单核细胞24 h后培养上清液中IL-10的水平；B为同一浓度的IL-17(100 ng/mL)刺激单核细胞不同时间点培养上清液中的IL-10水平。

图2 IL-17刺激和未刺激单核细胞培养上清液中IL-10水平的比较

2.2 不同信号通路抑制剂阻断IL-17刺激后培养上清液中IL-10水平的比较 基于IL-17可诱导单核细胞分泌IL-10，进一步探讨其可能的信号机制。在单核细胞培养体系中预先加入以下终浓度均为10 μmol/L的信号通路抑制剂进行阻断：NF-κB抑制剂 (BAY 11-7082)、MEK1/2抑制剂 (U0126)、p38/MAPK抑制剂 (SB203580)和 JNK抑制剂 (SP600125)。结果显示，在IL-17刺激的条件下，加入NF-κB抑制剂组IL-10 的水平明显低于未加抑制剂组(P<0.05)；而加入MEK1/2抑制剂、p38/MAPK抑制剂和 JNK抑制剂组IL-10 的水平则与未加抑制剂组差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。表明IL-17刺激单核细胞分泌IL-10并不依赖MEK1/2、p38/MAPK和JNK信号通路，而是依赖于NF-κB信号途径。

图3 不同信号通路抑制剂对IL-17(100 ng/mL)诱导单核细胞分泌IL-10的抑制效果

3 讨 论

IL-17R是传递Th17细胞信号的受体，主要由IL-17RA和IL-17RC以异二聚体的形式组成。Th17细胞的效应分子IL-17与IL-17R结合后，通过一系列的级联反应可激活多个包括NF-κB、MEK1/2、p38/MAPK和JNK在内的信号通路，进而促使基因的表达并转录翻译成蛋白后释放到胞外发挥作用[7-9]。

本研究发现，IL-17可刺激外周单核细胞分泌大量的调节性因子IL-10，而且具有剂量和时间依赖性，表明IL-17除了诱导上皮细胞产生促炎因子外，还可诱导髓样来源细胞产生抗炎因子，能够有效防止炎症应答导致的免疫损伤。但是IL-10在肿瘤中可抑制CD8+T细胞的抗肿瘤功能，提示IL-17在肿瘤中起着免疫抑制作用。此外，加入多个信号通路抑制剂检测IL-17诱导单核细胞分泌IL-10的信号机制，结果发现仅有NF-κB抑制剂能够明显抑制IL-10的分泌，而MEK1/2抑制剂、p38/MAPK抑制剂和JNK抑制剂则没有明显的变化，提示虽然IL-17可激活多个信号通路，但是诱导单核细胞分泌IL-10主要依赖于NF-κB信号而不依赖于MEK1/2、p38/MAPK和JNK信号。文献[10]报道，在肿瘤中除了巨噬细胞高表达IL-10，肿瘤细胞也可大量产生IL-10，那么，IL-17是否能够有效刺激肿瘤细胞分泌IL-10还有待进一步研究。

总之，IL-17可通过NF-κB信号通路诱导单核细胞分泌IL-10发挥免疫抑制作用，进一步全面阐明IL-17在不同疾病下的调节功能，将为发展针对细胞因子IL-17的免疫治疗提供帮助。

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Study on preliminary mechanism of monocytes secreting IL-10 induced by IL-17

WANGHang-zheng

(DepartmentofNuclearMedicine,AffliatedYongchuanHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China)

Objective To explore the molecular mechanism of IL-17-induced the secretion of IL-10 by monocytes.Methods The peripheral blood was collected from the healthy individuals undergoing the health physical examination in our hospital physical examination center,the mononuclear cells were isolated by ficoll density gradient centrifugation,and the CD14 positive monocytes were purified from mononuclear cells by using immunomagnetic beads.In vitro CD14 positive monocytes were stimulated by IL-17,or signal pathway inhibitors were pre-incubated for 1 h and then stimulated by IL-17,the level of IL-10 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results after IL-17 stimulation,the secretion of IL-10 by CD14 positive monocytes was significantly increased (P<0.01),which is in a dose and time dependent manner.However,IL-17-induced the secretion of IL-10 was significantly decreased while adding the NK-κB inhibitor (P<0.05),but the MEK1/2 inhibitor,p38/MAPK inhibitor and JNK inhibitor had no obvious inhibiting effect.Conclusion IL-17 could induce monocytes to secret IL-10 by the NK-κB signal pathway and thus plays the immunosuppressive effect.

IL-17; IL-10; NK-κB signal

王行政，男，本科，主管技师，主要从事免疫及电化学发光的临床应用研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.051

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1672-9455(2015)14-2095-02

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2015-03-25)