CMTM3表达下调参与肥厚性心肌病发病

徐 飞，蒋知言，王 欣，袁 昕，凤 玮

(中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心阜外心血管病医院心血管疾病国家重点实验室心外科，北京100037)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种临床上常见的心肌病，在世界范围内的人群发病率约为0.2%［1］，在中国成人患病率约为80/10 万［2］。该疾病的临床主要表现为非全身或心脏因素所引起的心室肥厚［3-4］。现已证实HCM为染色体显性遗传病，约50%的患者有家族遗传史，单基因突变即可致病［1］，散发患者约25%携带致病基因［5］，迄今已发现至少有20 个基因的400 余种突变与HCM 的发病相关。

CMTM 基因家族(CKLF-like MARVEL transmembrane containing family，CKLF 样MARVEL 穿膜结构域超家族)是一个新发现的基因家族，人类CMTM 基因家族包括9 个成员，CMTM3 为其成员之一。研究显示CMTM 家族成员的异常表达可以抑制细胞增殖，启动细胞凋亡［6-8］，并参与肿瘤的发生［9-10］。该家族成员在心脏疾病如肥厚性心脏病发病中的作用尚未有报道。

本研究应用异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌肥厚小鼠模型以及接受手术的肥厚性心肌病患者的心肌组织，探讨CMTM3 在肥厚性心肌病发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究收集2014年1月至2014年6月在阜外心血管病医院接受左室流出道疏通术的肥厚性心肌病32 例患者的心肌组织，对照组正常心室肌取自非心源性原因死亡患者捐献的心脏，共3 例，均为男性，室间隔厚度均正常。研究对象均签署知情同意书，并行超声心动检查。32 例肥厚性心肌病患者中，男性22 例，女性10 例;40 岁以下患者6 例，40～60 岁患者24 例，60 岁以上患者2 例;心功能Ⅱ级12例，Ⅲ级18 例，Ⅳ级2 例。平均室间隔厚度为(22.2 ±2.5)mm。患者手术均采用全麻低温体外循环下改良扩大Morrow 手术，术中切除异常肥厚室间隔组织，称重后部分送病理确诊，其余放入冷冻管内，液氮保存。肥厚性心肌病的诊断标准参考:压差≥50 mmHg，室间隔厚度≥18 mm，排除高血压等引起继发性心肌肥厚的因素及其他心血管疾病。本研究方案获得阜外心血管病伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备、组织取材:SPF 级C57BL/6小鼠，雄性，6 周龄，体质量18～20 g［北京百奥塞图基因生物技术有限公司，动物合格证号:SCXK (京)2012-0006］。共计40 只小鼠，分为实验组及对照组，每组各20 只。实验组小鼠按照每天15 mg/kg的剂量腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)(上海禾丰制药有限公司)，诱发心肌异常肥厚。对照组小鼠注射0.9%氯化钠溶液，连续注射7 d。使用小动物超声心动仪检测心脏，显示ISO 诱发左室壁厚度增大提示模型建立成功。

所有动物处死前称体质量，断颈处死后迅速取出心脏，称重，计算心脏/体质量比，心脏室间隔组织液氮保存用于检测提取RNA。动物实验操作均通过阜外心血管病医院动物伦理委员会论证。

1.2.2 Real-time PCR:1)总RNA 提取及cDNA 制备:小鼠心肌组织、来自临床标本的心肌组织各30 mg，用Trizol 试剂(Invitrogen 公司)提取总RNA，取1.0 μg总RNA 反转录为cDNA。2)RT-PCR 检测小鼠心肌CMTM3 mRNA 的表达水平:来自小鼠心肌组织标本取10 μg cDNA，RT-PCR 检测目的基因表达。引物序列如下:CMTM3 上游:5'-ACCGCGGCCCTCATCT ACTT-3'，下游:5'-TCTTGTGGGCTGTGGTCTCA-3';GAPDH 上游:5'-TCCTGGTATGACAATGAATACGG C-3'，下游5'-TCTTGCTCATGTGTCCTTGCTGG-3'。使用BIO-ID 凝胶分析系统进行PCR 产物半定量分析，基因相对表达量为目的基因与GAPDH 条带的吸光度比值。3)荧光实时定量PCR 检测患者心肌组织CMTM3 mRNA 表达水平:real-time PCR 引物序列:CMTM3 上游5'-ACCGCGGCCCTCATCTACT-3'，下游5'-AGGCCTTCAGTCAGAGTCC-3';β-actin 上游5'-CATCACAATGAAGATCAAGATCA-3'，下游5'-CG GACTCGTCATACTCCTGC-3'。利用MJ Option-2 实时荧光定量PCR 仪器进行检测，配套软件进行分析。使用2－△△Ct计算基因表达，并以β-actin 为内参，计算CMTM3 的相对表达量。所有样品设置2个实验平行，并重复检测3 遍。

1.2.3 Western blot 检测目的基因蛋白表达水平:组织总蛋白的提取与测定。取液氮中保存的心肌组织(临床标本)50～100 mg，去除残余组织，剪成小块，每50 mg 组织加入400 μL 组织裂解液以及4 μL PMSF，匀浆，离心，获取上清液。使用BCA 试剂盒(Pierce 公司)进行蛋白浓度测定。

样品经12.5% SDS-PAGE 胶电泳，100 V 1.5 h湿式电转移制硝酸纤维素膜上，分别与抗β-actin 抗体(Cell Signaling 公司)、anti-CMTM3 抗体及IRDyeTM800/700 conjugate 二抗(Santa Cruz 公司)结合，使用Odyssey Imaging System 仪器检测并分析。CMTM3 的相对表达量为目的蛋白与β-actin 吸光度比值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Cmtm3 在ISO 诱导的心肌肥大小鼠模型中表达下调

ISO 注射组小鼠心脏体质量比(mg/g)为5.6 ±0.4，明显高于对照组的4.4 ±0.1(P＜0.05，n =20)，证实ISO 诱发的心肌肥大模型建立成功。心肌肥厚的小鼠中Cmtm3 基因mRNA 相对表达水平为0.67 ±0.08，显著低于对照组的0.92 ±0.04(P＜0.05，n=20)(图1)。

图1 小鼠Cmtm3mRNA 表达电泳图Fig 1 Electrophoregram of Cmtm3 mRNA in various group of mouse

2.2 临床标本中CMTM3 的表达情况

在32 例HCM 患者以及3 例正常对照的心肌组织中均检测到CMTM3 mRNA 的表达。HCM 患者的相对表达水平为2.06±0.18，低于正常组的2.67±0.32。

HCM 患者室间隔心肌组织中CMTM3 蛋白表达相对含量为0.14 ±0.02，低于正常心肌的0.31 ±0.27(图2)。

图2 HCM 患者室间隔心肌组织CMTM3 蛋白表达情况Fig 2 The protein expression levels of CMTM3 in HCM patients

3 讨论

肥厚性心肌病虽然与肿瘤不同，但病变的心肌细胞也呈现出过度生长的趋势，最终导致心肌肥厚，增生和纤维化。本研究发现在ISO 诱导的小鼠肥大的心肌组织中CMTM3 表达下调，提示CMTM3 也参与调控心肌细胞的增殖。在人体组织中的研究也证实，正常人及肥厚性心肌病患者的心肌组织中都能检测到CMTM3 的表达，与正常组织相比，肥厚性心肌病患者增厚的室间隔心肌组织中，CMTM3 的蛋白表达量及CMTM3 转录水平均降低。本研究在异常肥厚心肌组织中发现了CMTM 家族成员的表达差异，提示CMTM3 不仅在肿瘤的发生中发挥作用，其表达下调还导致心肌细胞的过度增殖，参与肥厚性心肌病的发生。

心肌肥厚的发生是众多细胞信号传导机制共同作用的结果。某个基因的异常变化，如CMTM3 表达的异常下调，则可以导致某些增生性疾病的发生。本研究已经提示CMTM3 在调控心肌细胞的增殖和凋亡以及心肌肥厚发生中发挥了作用。CMTM3 抑制肿瘤细胞增殖的作用与其甲基化表达相关，在心肌细胞中是否也有这样的调控机制尚不明确，有待深入研究。

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