LNAzyme特异性阻断丙肝病毒5'-NCR/C基因表达

邓益斌，农乐根，梁祚仁，覃羽华

(右江民族医学院附属医院医学检验科，广西百色533000)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是单股正链RNA 病毒，含5'非编码区(5'-NCR)、结构区(C、E 区)、非结构区(NS 区)和3'非编码区(3'-NCR)，其中，5'-NCR 和C 区是丙型肝炎病毒复制所必需的元件，是HCV 最保守的区域［1］，具有重要的生物学功能，是抗HCV 基因治疗的理想靶位。C区的编码蛋白是大分子多聚蛋白前体，在宿主信号肽酶及NS3 蛋白激酶的作用下裂解成各种小分子病毒蛋白，很显然，C 区在病毒基因表达调控中发挥着重要的作用。因此，推测切割破坏该位点RNA序列可能有效阻断病毒的基因表达。锁核酸核酶(LNAzyme)是在脱氧核酶的2 条结合臂上引入1 个或多个锁核酸单体构建而成的新型核酸酶，与其他核酸酶相比，具有更强的分子杂交能力、更高的酶切活性和切割效率［2-5］。前期本研究针对HCV 5'-NCR 的内源性核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)设计合成的锁核酸核酶对HCV 基因表达显示较强的抑制作用［6］。因此，本研究进一步针对丙型肝炎病毒C 区设计合成两侧臂长约8～10 nt、环结构为GGCTAGCTACAACGA 的LNAzyme，以半乳糖配体介导转染HepG2.9706 细胞系，进一步观察同时切割病毒5'-NCR 和C 区对病毒复制与表达的影响，以期为抗HCV 治疗寻找多靶位联合的新型分子药物。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2.9706 细胞是一种转染有丙型肝炎病毒5'-NCR-C 基因并稳定表达的HepG2 细胞，含荧光素酶基因(中国人民解放军广州军区空军医院基因工程实验室刘光泽博士惠赠)，本室常规培养于含G418(380 ITI1)、10% 胎牛血清的DMEM 培养基中;DMEM 培养基、G418、Trizol RNA 提取试剂盒等(Gibco 公司);胎牛血清(杭州四季清公司);半乳糖配体(jetPEITM)(Polyplus 公司);荧光定量PCR 检测HCV RNA 试剂盒(深圳匹基公司);化学发光试剂盒(Bright-GloTM荧光素酶分析系统)(Promega 公司)。

1.2 方法

1.2.1 核酶分子设计与合成:分别合成互补于HCV 5'-NCR 基因区IRES 位点245～265 nt 的NCR片段(5'-GALCTLGCTALGCGGCTAGCTACAACGACG AGTALGTLGTLC-3')及互补于HCV C 基因区341～356 nt 的C 片段(5'-TALGGALTLTGGCTAGCTACAA CGACGAGTLGCTLCALT-3')，其中，两侧靶位特异性识别序列的碱基A 或T 上标的“L”为LNA 单体，下划线部分(GGCTAGCTACAACGA)为酶的催化活性序列(图1)。经BLAST 分析，排除链间碱基互补以及与人同源后，由美国Genelink 公司合成修饰。

1.2.2 实验分组与脂质体转染:本实验分对照组和实验组。对照组包括空白对照组、和半乳糖配体对照组。实验组包括单靶区NCR 组、单靶区C 组和双靶区NCR/C 组。将HepG22.9706 细胞按1 ×105个/mL 接种于16 孔培养板，每孔100 μL，共设定5 个组，每组设6 个复孔，待细胞贴壁后吸取培养上清液(－20 ℃保存)，分别在各组每孔中1 次性加入含核酶量为10 μmol/L 的DMEM 混合液1 mL，分别于24、48 和96 h 收集各孔培养上清液500 μL，保存于－20 ℃待测。半乳糖配体转染严格按说明书操作。

1.2.3 培养上清液HCV RNA 含量检测:采用荧光定量PCR 试剂盒法。1)在预先准备好的1.5 mL 灭菌离心管中加入RNA 酶抑制剂20 μL，然后分别加入待测液，阴、阳性对照和标准品各100 μL，再加入裂解液100 μL，振荡混匀。2)将上述混合液全部转移至核酸提取柱中，开启负压装置，抽干液体，然后分别用洗涤液A 和B 液各500 μL，各洗涤1 次，抽干。3)关闭负压装置，将提取柱转入2 mL 离心管中，15 000 r/min，离心1 min。4)将提取转入新2 mL 离心管中，加入50 μL 洗脱液，静置1 min，10 000 r/min，离心1min，取12.5 μL 洗脱液加样，余下步骤和PCR 扩增条件严格按说明书操作。结果采用计算对数平均值的方法获得cDNA 平均拷贝数。

图1 HCV 5'-NCR/C 融合基因表达盒结构示意图Fig 1 The box structure of HCV 5'-NCR/C fusion gene expression

1.2.4 培养细胞内荧光蛋白表达检测:分别于基因转染后24、48 和96 h 终止培养，将培养板室温平衡30 min，向每孔中加入经室温平衡后的荧光素酶发光试剂100 μL，轻轻摇匀2 min 以使细胞完全裂解，立即应用VictorTMWallac 1420 多标记检测仪检测1 s发光强度，输出值以每秒周数(counts/s)表示。

1.2.5 荧光显微镜系统观察细胞荧光蛋白表达:培养细胞转染96 h 后，用倒转荧光显微镜系统在488 nm 激发波长下观察绿色荧光的表达情况，并拍照。

1.2.6 LNAzyme 对细胞活性影响检测:采用MTT比色法检测LNAzyme 对细胞活性的影响。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 LNAzyme 对HCV RNA 复制的抑制

加入LNAzyme 后，无论是单靶区组还是双靶区组，对HCV RNA 的复制均显示出较强的抑制作用(F=77.50，P＜0.05)，单靶区NCR 组、单靶区C 组和双靶区NCR/C 组的平均抑制率分别为62.12%、61.39%和75.37%。与用药前比较，HCV RNA 的含量也明显下降(F =56.21，P＜0.05)，用药后24、48 和96 h 的平均下降率分别为52.36%、66.81%和75.05%(表1)。

2.2 LNAzyme 对培养细胞荧光素酶基因表达的抑制

锁核酸核酶对细胞荧光素酶基因的表达也显示出较强的抑制作用(F =48.65，P＜0.05)，单靶区NCR 组、单靶区C 组和双靶区NCR/C 组的平均抑制率分别为66.49%、65.06%和73.30%。与用药前比较，荧光素酶的表达量也明显下降(F =46.21，P＜0.05)，用药后24、48、96 h 的平均下降率分别为53.02%、62.98%和79.45%(表2)。

表1 LNAzyme 对HepG2.9706 细胞HCV RNA 复制的影响Table 1 The inhibitory effect of LNAzyme on replication of HCV RNA in HepG2.9706 cells(±s，1×105 copies/mL，n=6)

表1 LNAzyme 对HepG2.9706 细胞HCV RNA 复制的影响Table 1 The inhibitory effect of LNAzyme on replication of HCV RNA in HepG2.9706 cells(±s，1×105 copies/mL，n=6)

＊P＜0.05 compared with control groups;△P＜0.05 compared with NCR group;#P＜0.05 compared with C group;▲P＜0.05 compared with before transfection.

group0 hour24 hours48 hours96 hours blank control1.52 ±0.441.55 ±0.471.61 ±0.521.65 ±0.44 gal-ligand control1.62 ±0.451.58 ±0.461.67 ±0.441.65 ±0.43 NCR1.65 ±0.440.78 ±0.310.53 ±0.220.31 ±0.15 C 1.69 ±0.440.81 ±0.310.50 ±0.220.34 ±0.15 NCR/C1.64 ±0.480.51 ±0.230.25 ±0.180.18 ±0.11＊△#▲

表2 LNAzyme 对HepG2.9706 细胞荧光素酶基因表达的影响Table 2 The inhibitory effect of LNAzyme on expression of luciferase in HepG2.9706 cells(±s，1 ×104 counts/s，n=6)

表2 LNAzyme 对HepG2.9706 细胞荧光素酶基因表达的影响Table 2 The inhibitory effect of LNAzyme on expression of luciferase in HepG2.9706 cells(±s，1 ×104 counts/s，n=6)

＊P＜0.05 compared with control groups;△P＜0.05 compared with NCR group;#P＜0.05 compared with C group;▲P＜0.05 compared with before transfection.

group blank control 0 hour24 hours48 hours96 hours 4.97 ±2.924.85 ±2.894.91 ±2.814.87 ±2.79 gal-ligand control4.81 ±2.914.91 ±2.854.89 ±2.754.93 ±2.87 NCR4.92 ±2.452.01 ±1.521.55 ±1.230.71 ±0.25 C 4.79 ±2.452.11 ±1.521.66 ±1.230.75 ±0.25 NCR/C4.83 ±2.451.85 ±1.021.14 ±0.530.23 ±0.15＊△#▲

2.3 LNAzyme 对细胞荧光蛋白表达抑制情况

转染96 h 后，荧光显微镜下观察发现，表达绿色荧光蛋白的细胞数，双靶区NCR/C 组(15% ±12%)明显少于单靶区NCR 组(25% ±16%)、单靶区C 组(28% ±18%)和对照组(85% ±30%)(图2)。

2.4 LNAzyme 对细胞活性的影响

用药96 h 后，单靶区NCR 组、单靶区C 组和双靶区NCR/C 组的A 值分别为1.03 ±0.05、1.00 ±0.05 和1.04 ±0.08，与空白对照组的1.11 ±0.06比较均无差异。

3 讨论

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染会导致慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌等重症肝脏疾病，但迄今为止仍无理想的治疗方法及有效的预防性疫苗可利用。HCV 是单股正链RNA 病毒，含5'非编码区(NCR)、结构区(C、E 区)、非结构区(NS 区)、和3'非编码区(NCR)，其中，5'-NCR 区是丙型肝炎病毒复制所必需的元件，是HCV 最保守的序列之一，其内源性核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)在病毒基因表达调控中发挥着重要的作用，是病毒基因组中唯一的一个翻译起始位点［7］;C 区的编码蛋白是大分子多聚蛋白前体，在宿主信号肽酶及NS3 蛋白激酶的作用下，合成至少5 种重要的抗原表位［8-9］，这表明C 区可能与HCV 的免疫致病及防御密切相关。据此推测，同时切割破坏病毒5'端的NCR 和C 区可能特异性阻断病毒基因的复制与表达。锁核酸核酶(LNAzyme)是在脱氧核酶的2 条结合臂上引入1 个或多个锁核酸单体构建而成的新型核酸酶，与其他核酸酶相比，具有更强的分子杂交能力、更高的酶切活性和切割效率。研究发现，针对乙型肝炎病毒前C/C 区设计合成的锁核酸核酶，体外能有效抑制乙肝病毒HBsAg、HBeAg 的表达［10-11］。

图2 LNAzyme 对细胞荧光蛋白表达的抑制作用Fig 2 The inhibitory effect LNAzyme on expression of luciferase(×100)

本研究针对HCV 5'-NCR/C 双靶位点设计合成LNAzyme，并以半乳糖配体介导转染HepG2.9706 细胞，LNAzyme 分子两侧的靶特异性结合序列分别与5'-NCR、C 基因互补结合，酶活性结构发挥切割作用，破坏病毒RNA 分子，达到阻断病毒复制与表达的目的。研究结果发现，转染锁核酸核酶后，无论是单靶区组还是双靶区组，HCV RNA 的复制和荧光素酶基因的表达均显著下降，且双靶区组下降更为明显。96 h 后，双靶区组的HCV RNA 和荧光素酶的平均下降率分别达74.05%和79.45%。而荧光显微镜检测结果也显示荧光蛋白阳性细胞数均较对照组减少，说明半乳糖配体介导的锁核酸核酶能有效切割靶基因序列，发挥抗HCV 复制与表达的作用，且呈时效关系。此外，MTT 比色结果表明，LNAzyme对细胞活性基本无影响。总之，针对HCV 5'-NCR/C 双靶区的锁核酸核酶，体外能特异性抑制病毒基因表达，为抗丙型肝炎病毒基因治疗提供理论和实验依据，有望成为RNA 病毒基因治疗的新型反义核酸药物。

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