原花青素对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖和凋亡的影响

马 磊，陈维英，施又丹，陈 欢，陈倩竹，张 力，2，唐 俐，2，李龙江，2*

(重庆医科大学基础医学院1.病理生理学教研室;2.干细胞与组织工程研究室，重庆400016;3.青海红十字医院肿瘤科，青海西宁810000;4.宜昌市中心人民医院呼吸内科，湖北宜昌443003)

髓母细胞瘤是一种好发于儿童中枢神经系统的高度恶性肿瘤，生长迅速、侵袭性强，具有较高的病死率和致残率［1］。目前，虽其治疗以手术为主［2］，但化疗仍是髓母细胞瘤最重要的辅助治疗手段。寻找抗肿瘤活性强、毒性及耐药性小的纯天然药物，研究出新的联合化疗方案，提高患者的生存率和生活质量受到研究者关注。原花青素(proanthocyanidins，PC)是由不同数量的儿茶素缩合而成的一种经典酚类化合物，广泛存在于众多植物当中。研究表明，原花青素可抑制多种肿瘤，如卵巢癌［3］、乳腺癌［4］、肺癌［5］和胰腺癌［6］等。然而，原花青素能否应用于髓母细胞瘤的治疗，尚无相关报道。故而，本研究利用体外培养方法探讨原花青素对髓母细胞瘤Daoy 细胞增殖能力和凋亡的影响及其初步作用机制，为选择治疗髓母细胞瘤的天然药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

原花青素(美国贝尔兰科公司标准品)，相对分子质量432.5188，易溶于水，以无血清MEM 培养液配制成4.4 mmol/L 的原花青素储备液，4 ℃保存。髓母细胞瘤Daoy 细胞系(上海志研生物科技有限公司，来自ATCC)。标准胎牛血清、MEM 培养基(Hyclone 公司)。Hoechst33258、AnnexinV－FITC/PI双染试剂盒(上海凯基生物有限公司)。Akt、p－Akt、NF－κB(P65)抗体(CST 公司)。CCK－8 和免疫印迹实验相关试剂(碧云天生物有限公司)。甲醇、过硫酸铵、胰蛋白酶、氯化钠等常规试剂(重庆医科大学组织工程与干细胞研究室)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:髓母细胞瘤Daoy 细胞系采用含10%标准胎牛血清的MEM 培养液，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔48 h 换液1 次，待细胞增殖状态良好，铺满至80%瓶壁时以1 ∶3 的比例传代。

1.2.2 CCK－8 检测细胞增殖活性:取对数增殖期细胞，消化离心后制成细胞悬液，细胞计数调整浓度，取100 μL 分别接种于96 孔板(5 ×103个/孔)，培养24 h 后，分别加入用MEM 配制的终浓度为0.025、0.05、0.1、0.2 和0.4 mmol/L 的原花青素工作液10 μL/孔，各3 孔，为实验组;细胞对照组加入无药的MEM 培养基，100 μL/孔;另设无细胞空白对照组。分别于培养24、48 和72 h 后每孔加入CCK－8 工作液10 μL，继续培养4 h，振摇10 s，酶标仪450 nm 处测定各孔吸光度值(A450)。

1.2.3 Hoechst33258 荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化:取对数增殖期细胞，消化离心制成细胞悬液，细胞计调整细胞数至1 ×105个/mL 后接种于6 孔板，2 mL 每孔。培养过夜后实验组加入用MEM配制的终浓度为0.2 mmol/L 原花青素，对照组加入MEM 培养基。分别培养24、48 和72 h 后，弃培养液，PBS 稍洗，收集细胞。4%多聚甲醛固定10 min，弃固定液，PBS 洗3 次。加入0.5 mL Hoechst33258染色液(20 μg/mL)，37 ℃孵育15 min，荧光显微镜下观察细胞形态，细胞核致密浓染或成碎块状致密浓染为凋亡细胞。

1.2.4 Annexin－V/PI 染色检测细胞凋亡:细胞分组及处理同上。流式细胞仪检测凋亡细胞数和死亡细胞数，具体步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.2.5 Western blot 检测Akt、p－Akt、NF－κB(P65)表达的水平:原花青素0.2 mmol/L 处理Daoy 细胞24、48 和72 h 后，分别提取其总蛋白，并用酶标仪测定其蛋白含量，免疫印迹法检测Akt、p－Akt、NF－κB(P65)的表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0 软件进行数据分析，数据以均数±标准差(±s)表示，样本均数的比较采用单因素方差分析以及两独立样本的t 检验。

2 结果

2.1 原花青素对Daoy 细胞增殖抑制作用

随着原花青素浓度的增加和作用时间的延长，其对Daoy 细胞增殖抑制逐渐增高，呈时间－剂量效应(图1)。采用直线回归方式计算PC 作用Daoy 细胞72 h 的半数抑制浓度IC50为0.25 mmol/L，故而后续研究以0.2 mmol/L 为固定浓度开展。

图1 不同浓度原花青素作用不同时间对Daoy细胞的增殖抑制作用Fig 1 Different concentrations and different treating periods of PC inhibited the proliferation of Daoy cells(±s，n=3)

2.2 Hoechst33258 染核观察原花青素处理后细胞形态变化

对照组细胞呈均匀蓝色荧光。原花青素作用24、48 和72 h 后，细胞核荧光强度增加，出现明显皱缩、聚集、碎裂，细胞发生凋亡(图2)。

图2 Hoechst33258 染核观察原花青素(0.2 mmo/L)处理细胞后形态学变化Fig 2 Hoechst33258 staining showed the morphologic changes of PC-treated cells and control cells(×400)

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率

0.2 mmol/ L 的PC 与Daoy 细胞共孵育24、48和72 h 后，其凋亡率分别为21.16% ± 2.49%、36.02% ±0.71%、63.79% ±1.47%，对照组则分别为1.45% ± 0.04%、1.70% ± 0.01%、2.17% ±0.21%，原花青素组出现了较多的凋亡和死亡细胞，并随着时间梯度呈递增趋势(图3)。

2.4 Western blot 检测Akt、p-Akt、NF-κB(P65)蛋白在髓母细胞瘤Daoy 中的表达

经原花青素处理后，p－Akt 与NF－κB(P65)的表达较对照组明显下调，并呈时间－效应关系(图4)。

3 讨论

大量研究证实，原花青素具有抗氧化、抗突变、抗感染等多种生物活性，且毒性及不良反应小，符合人们对安全性的需要。此外，体内外实验均证明原花青素能够选择性抑制肿瘤细胞的生长，促进其凋亡，而对正常的组织细胞没有杀伤作用［7］。

本研究采用CCK－8 法观察到原花青素对人髓母细胞瘤Daoy 细胞存在增殖抑制作用，并呈时间－剂量依赖性。通过Hoechst33258 染核以及annexin－V/PI 染色检测发现原花青素具有诱导Daoy 细胞凋亡的能力，并随着作用时间的延长，Daoy 细胞发生凋亡率也随之增加，提示原花青素在体外对肿瘤细胞的抑制作用与诱导凋亡有关。

图3 原花青素(0.2 mmo/L)处理细胞与对照组细胞凋亡率变化Fig 3 Apoptotic rate of PC-treated cells and control cells

图4 Western blot 检测原花青素(0.2 mmo/L)诱导Daoy 细胞的Akt、p-Akt、NF-κB(P65)蛋白表达变化Fig 4 Expression of Akt，p-Akt and NF-κB(P65)protein was detected by Western blot in PC-treated cells and cells in the control group

PI3K－Akt 是细胞内极为重要的信号传导通路之一，PI3K 可以磷酸化激活Akt，然后再激活或抑制其下游靶蛋白caspase9、NF－κB 和P21 等［8］，调控细胞增殖和凋亡。该通路的活化与肿瘤的发生发展密切相关，研究表明，活化的PI3K－Akt 信号通路广泛存在于人类肿瘤中，如结肠癌［9］、乳腺癌［10］、非小细胞肺癌［11］以及髓母细胞瘤［12］等。

原花青素能抑制髓母细胞瘤Daoy 细胞增殖和诱导凋亡，其机制是否与PI3K－Akt 通路有关?本研究结果显示，0.2 mmol/L 原花青素作用肿瘤细胞不同时间后，总Akt 的表达几乎没有明显的差异，但其活性形式p－Akt 水平明显降低，提示原花青素的抗肿瘤活性可能是抑制了Akt 的活化，导致该信号通路受阻。进一步检测该信号通路下游的转录因子NF－κB(P65)，也发现其表达降低，这与p－Akt 水平降低相吻合。上述结果初步表明原花青素可能是通过抑制了肿瘤细胞中的PI3K－Akt 信号通路及其下游的转录因子NF－κB 来发挥其抗瘤效应。

通过本研究发现，原花青素在体外对髓母细胞瘤Daoy 细胞有抗瘤作用，其机制与抑制PI3K－Akt通路活性有关，但尚需深入研究，寻找作用靶点，为将原花青素应用于髓母细胞瘤的临床化疗提供理论依据。

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