过表达钙周期蛋白S100A6对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞生物学行为的影响

刘泽群，曹 青，陈美红，张晓玲*

(1.南昌大学医学部研究生院妇产科;2.江西省医学分子重点实验室;3.江西省妇幼保健院妇科，江西南昌330006)

S100A6 也称为钙周期蛋白(calcyclin，Cacy)，是S100 家族成员之一，是具有EF-手型结构的Ca2+结合蛋白，主要通过与Ca2+以及靶蛋白相互作用广泛参与细胞的增殖、周期调节、基因转录以及细胞分化等生物学过程。近年的研究发现，在结肠癌细胞中，S100A6 可以调节细胞的迁移和增殖能力［1］。在对食管癌的研究中也发现，通过沉默S100A6 基因的表达能明显抑制细胞的增殖和迁移能力［2］。子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是常见的妇科疾病，病理上虽然是良性疾病，但是却具有远处转移、新生血管生成及不断增殖等类似恶性肿瘤的性质。目前国内外关于S100A6 和EMs 的研究还不是很多，本项目组之前的研究发现，EMs 在位子宫内膜间质细胞中S100A6 存在高表达［3］。本研究拟在体外培养的EMs 在位子宫内膜间质细胞中上调S100A6 的表达，探讨其能否影响细胞的生物学行为，以期为今后的分子靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及慢病毒:EMs 在位子宫内膜间质细胞取自在江西省妇幼保健院住院行腹腔镜手术或开腹手术、病理检查确诊的EMs 患者(患者签署知情同意书)，重组慢病毒S100A6(上海吉玛制药技术有限公司)。

1.1.2 试剂:新生的胎牛血清(BI 公司)，DMEM/F12 培养基(Hyclone 公司)，0.25%胰蛋白酶和细胞计数试剂盒(cell counting kit，CCK-8)(北京全式金公司)，Transwell 小室(BD 公司)，Annexin V-PE Reagent 凋亡试剂盒(杭州联科生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组:EMs 在位子宫内膜间质细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培养基，放置于5% CO2、37 ℃、相对湿度100%的培养箱中培养，细胞呈贴壁增殖，转染前2 d，以60%～70%的密度传代培养，将重组慢病毒S100A6 按照转染试剂说明书侵染至EMs 在位子宫内膜间质细胞中。根据侵染病毒的不同，实验分为3 组:对照组(未做处理组，blank group)、干预组(仅转染慢病毒载体，negative group)和Lv-S100A6 组(转染含有S100A6 慢病毒，Lv-S100A6 group)。转染后24 h 更换新鲜培养基。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞增殖活性:转染换液后48 h，用0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，离心后重悬于新鲜DMEM/F12 完全培养基，铺于96 孔板中，0.3×103个/孔(100 μL/孔)，细胞培养24、48、72 和96 h 后按说明加入CCK-8 试剂(10 μL/孔)，继续培养4 h，在酶联免疫仪器上检测450 nm 波长处各孔的吸光度值。

1.2.3 Transwell 法检测细胞迁移:转染换液后48 h，将Transwell 培养小室置于24 孔板中，取2 ×103个转染后细胞重悬于300 μL 无血清培养基中，将细胞混合样缓慢加入小室的上层，小室下层缓慢加入含有20%胎牛血清的培养液，培养48 h 后染色，置于镜下观察计数并拍照。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡:转染换液后48 h，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化细胞，预冷PBS 重悬细胞2 次，第2 次移除PBS，按照Annexin V-PE Reagent 凋亡试剂盒说明书操作。1 h 内进行流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0 统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差(±s)，两组间数据比较采取t 检验，两组以上数据比较采取方差分析。

2 结果

2.1 重组S100A6 能促进EMs 在位子宫内膜间质细胞增殖

转染48 h 后，Lv-S100A6 组的A 值较之对照组和干预组明显增加(P＜0.05)(图1)。

图1 CCK-8 法检测转染后EMs 在位子宫内膜间质细胞增殖Fig 1 The cell proliferation of eutopic endometrial stromal cells was detected by CCK-8 assay after transfected with recombinant lentivirus S100A6(n=4)

2.2 过表达S100A6 能增强EMs 在位子宫内膜间质细胞迁移能力

Lv-S100A6 组细胞的穿膜数明显高于对照组和干预组(P＜0.05)(图2)。

2.3 过表达S100A6 能抑制EMs 在位子宫内膜间质细胞的凋亡

Lv-S100A6 组细胞的凋亡率较对照组和干预组明显下降(P＜0.05)(图3)。

3 讨论

EMs 是常见的妇科良性疾病，但其具有细胞增生、侵袭和复发等类似肿瘤细胞的特性。EMs 在位内膜与正常子宫内膜组织之间存在差异，包括增殖能力、黏附能力及侵袭能力等异常的生物学行为对EMs 的发生有重要作用［4］。有研究发现，S100 蛋白家族和EMs 有着密切的联系。在正常子宫内膜和EMs 在位内膜组织上均存在S100A4 的表达，并且EMs 在位内膜细胞中S100A4 的表达要高于正常子宫内膜组织［5］。

S100A6 是一个由90 个氨基酸残基形成的钙结合蛋白，也属于S100 蛋白家族的一员。S100 蛋白家族广泛参与细胞周期活动、细胞分化、肿瘤生长等过程［6］。本项目组之前的研究发现，EMs 在位子宫内膜间质细胞中S100A6 存在高表达，与细胞的增殖和迁移呈正相关，和细胞凋亡呈负相关［3］;过表达S100A6 可以提高EMs 在位子宫内膜间质细胞中β-catenin 的表达。有研究发现，结肠子宫内膜异位症病灶中β-catenin 的表达明显高于正常子宫内膜［7］。在乳腺癌中，S100A6 可以上调MCF-7 细胞系中β-catenin 的表达［8］。β-catenin 是Wnt/β-catenin 信号通路中重要的转录因子，Wnt/β-catenin 信号通路可能参与了EMs 的形成和发展［9］。在本实验中，通过上调S100A6 的表达，EMs 在位内膜间质细胞的增殖和迁移能力明显增强，而细胞的凋亡则呈现抑制状态，这与之前的研究结果相符合。这表明S100A6 对EMs 生物活性的影响有可能是通过Wnt/β-catenin 信号通路来实现的。

图2 Transwell 法检测转染后EMs 在位子宫内膜间质细胞迁移Fig 2 Transwell assay was performed to detect the migratory ability of eutopic endometrial stromal cells after transfection(×200，n=4)

图3 流式细胞术检测转染后EMs 在位子宫内膜间质细胞凋亡Fig 3 The apoptosis rate of eutopic endometrial stromal cells was detected by flow cytometry after transfection(n=4)

综上所述，S100A6 在EMs 在位子宫内膜间质细胞中存在高表达，而且对细胞的增殖、迁移和凋亡能力有明显影响，这同EMs 的侵袭和种植有密切联系，对进一步探究EMs 的发病机制有重要作用，同时为EMs 的分子靶向治疗提供了一定的参考。

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