血栓素受体参与子痫前期的发病

胡继芬，何芳杰，陈丽红，吴建波

(福建医科大学附属第一医院妇产科，福建福州350005)

子痫前期(preeclampsia)是妊娠期特有疾病，发病率占妊娠总数的2%～8%，目前是威胁孕妇和围产儿健康状况的主要疾病之一［1］。子痫前期的病因和发病机制并未完全阐明，主流观点认为发病过程包括两个阶段:胎盘形成不良及胎盘氧化应激。本研究主要针对子痫前期胎盘氧化应激时TXS、TXA2、TPr 和NOX1 的蛋白及mRNA 表达情况，同时结合临床资料来阐述子痫前期的发病机制。

1 材料与方法

1.1 病例选择

收集2011年12月至2013年9月在福建医科大学附属第一医院以剖宫产手术终止妊娠的子痫前期孕妇36 例为病例组，随机选取因产科因素以剖宫产终止妊娠的正常孕妇34 例为对照组，病例组的诊断标准参考威廉姆斯产科学第23 版［1］。本次研究对象均无其他妊娠相关产科并发症、妊娠期内外科合并症，且均未进入产程。所有入组患者均签署知情同意书，同意患者的组织标本用于本实验研究。

1.2 试剂

兔抗人TXS 及NOX1 多克隆抗体(Abcam 公司)、兔抗人TPr 多克隆抗体(Santa Cruz 公司)。即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒和DAB 显色试剂盒(福州迈新生物技术开发公司);TXB2 试剂盒(R＆D 公司);RNA 反转录录试剂盒(TaKaRa 公司)。

1.3 标本处理

所有研究对象的胎盘娩出后，立即在胎盘脐带附着处(对侧)母体面取3 块胎盘组织，大小约为1 cm×1 cm×1 cm，用PBS 反复漂洗后，滤纸吸干，两块放于液氮中，以上操作在5 min 内完成，1 h 后转移到－70 ℃冰箱中保存，一块放于10%甲醛溶液中固定，过夜后石蜡包埋。

1.4 免疫组化检测

常规石蜡包埋后的蜡块行连续切片，采用Max-VisionTM一步法按试剂盒说明书在同等条件下行免疫组化染色。TXS(一抗浓度1∶100)、TPr(一抗浓度1∶100)及NOX1(一抗浓度1∶200)均采用酸性修复，室温下孵育1 h。Tris-HCl 缓冲盐溶液(TBS)代替一抗作为阴性对照。免疫组化的结果判定采用双人双盲平行评价的方法。在光学显微镜下随机选取10 个有代表性的高倍视野，计数显色定位准确的阳性细胞染色率和染色强度，分类如下:0%～5%细胞质染色为(－)，6%～25%细胞质染色为(+)，26%～50%细胞质染色为(+ +)，＞50%细胞质染色为(+ + +)，(－)－ (+)为阴性表达，(+ + )－(+ + +)为阳性表达［2］。

1.5 Real-time PCR

测定mRNA 表达采用Trizol 法按照试剂说明提取总RNA。采用反转录试剂盒，按照试剂盒操作步骤将总mRNA 反转录成cDNA。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，TXS、TPr、NOX1 和GAPDH 的引物序列见表1。采用Applied Biosystems7500 两步法PCR 扩增标准程序:预变性95 ℃30 s;95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 个循环;95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。

表1 TXS、TPr、NOX1 和GAPDH 基因引物序列Table 1 TXS，TPr，NOX1 and GAPDH primers

1.6 统计学分析

应用SPSS16.0 软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，计数资料采用率标书，组间比较采用卡方检验，相关关系采用Spearson 直线相关分析。

2 结果

2.1 临床资料

两组研究对象在年龄上无差异，但在终止孕周、收缩压、舒张压和平均动脉压方面高于对照组，而新生儿体质量降低(P＜0.05)(表2)。

2.2 免疫组化结果

TXS、TPr 及NOX1 蛋白主要表达于胎盘组织细胞滋养细胞、合体滋养细胞、少量绒毛血管内皮细胞的胞质中(图1)。TXS 及NOX1 病例组中阳性表达率分别为30.6%(11/36)和16.7%(6/36)，显著低于对照组64.7%(22/34)和55.9%(9/34)(P＜0.05)。

表2 两组患者临床基线情况比较Table 2 The general characteristics of the two groups

图1 TXS、TPr 及NOX1 在胎盘组织细胞滋养细胞、合体滋养细胞、绒毛血管内皮细胞胞质中的表达Fig 1 TXS，TPr and NOX1 expression by immunohistochemical assay(×400)

2.3 Real-time PCR 结果

病例组TXS、NOX1 mRNA 相对表达量分别为2.1 ±1.7 和3.9 ±2.7，显著高于对照组的1.4 ±1.2和2.1 ±1.7(P＜0.05)。

2.4 ELISA 检测TXB2 表达

病例组胎盘组织TXB2 表达为125.6 ±47.4，显著高于对照组的102.3 ±33.1(P＜0.05)。

2.5 相关性病例组

胎盘组织TXB2 表达量与新生儿体质量呈负相关(r = －0.446，P＜0.05);病例组胎盘组织TXB2表达和NOX1 mRNA 表达呈正相关(r =0.367，P＜0.05)。

3 讨论

TXS 是细胞色素P450 超家族成员，前列腺素H2 在TXS 的催化下生成TXA2。TXA2 具有强烈的使血小板活化聚集、平滑肌收缩的功能，参与动脉粥样硬化形成［3］、新血管形成、过敏反应及免疫调节等。子痫前期TXS 在胎盘滋养层和蜕膜细胞高表达，且高于对照组，认为局部高表达的TXS 是导致子痫前期胎盘血管病变的重要因素［4］。有报道TXS在子痫前期患者胎盘及蜕膜的表达与对照组无差异［5］。造成此结果的不一致可能与病例数少、子痫前期诊断标准的更新、实验方法不同等因素有关，因此有必要对上述结果进行深入研究。本研究中TXS高表达于病例组胎盘的滋养细胞层、间质细胞和绒毛中心血管，并且发现滋养层细胞高表达TXS 能催化产生更多的TXA2 产物，这可能是导致子痫前期胎盘血管收缩而处于氧化应激的重要原因［6］。另有研究［7-8］发现TXS 在母体全身血管高表达是导致子痫前期临床症状的原因。

TPr 是G 蛋白耦联受体，TXA2 通过与TPr 结合导致受体发生变构而活化，引起生理反应。升高的TXA2 通过与TPr 结合使TPr 活化，并激活下游通路，但TPr 表达量无改变。免疫组化研究结果表明胎盘中TPr 表达量在病例组升高［6］。NOX1 是非吞噬细胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase，NOX)家族的一员。有研究［9］发现NOX1 在子痫前期胎盘合体滋养细胞及血管内皮细胞表达较对照组升高。本研究TXA2 与NOX1 呈低度正相关，体外研究实验表明TXA2 激活其受体TPr，可导致其下游PKC 通路激活，导致NOX1 表达升高［10-11］。但实验结果相关性程度较低，可能是因为除了TXA2，异前列腺素也能通过激活TPr 通路引起胎盘血管病理生理反应［12-13］。本实验结果TXA2 与NOX1 低度正相关的原因可能是由于在子痫前期患者胎盘中存在其他表达升高的配体如异前列腺素等其他物质，它们也能通过活化TPr 来调节NOX1 的表达，且其影响较为显著，从而导致TXA2 与下游产物NOX1 低度正相关。

综上所述，TXA2 可能通过活化的TPr 信号通路使NOX1 表达升高，产生大量ROS，参与子痫前期发病过程。针对此通路的后续研究将有助于子痫前期的预防及预测，并且能够降低孕产妇和围产儿的不良结局。

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