贵州地区汉族人群GDF5基因单核苷酸多态性与成人终身高的关系

赵 甜，朱惠娟，龚凤英，李乃适，单广良，潘 慧*，班 博

(1.山东大学医学院，山东济南250012;2.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院内分泌科卫生部内分泌重点实验室协和转化医学中心，北京100730;3.中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院流行病学与统计学系，北京100005;4.济宁医学院附属医院，山东济宁272029)

个体的最终身高由遗传、环境、心理和疾病等因素相互作用而决定。研究证实身高是由多基因共同控制的数量遗传性状［1］，其遗传度为80%～90%［2-3］。随着分子生物学技术的发展和人类基因组计划的实施，影响人类性状形成和复杂性疾病产生的遗传学研究在国内外不同人群中已广泛展开。本研究基于全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)结果并结合近年来国内外文献报道的身高相关基因数据，选取生长分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF5)基因rs143383、rs143384、rs6060369 和rs224331 共4 个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，对中国贵州地区1 069 例年龄为20～59 岁的汉族人群终身高进行了关联分析研究，从而探索与汉族人群身高相关联的基因及其SNPs 对身高个体差异的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:现场调查为横断面研究方法，采用分层整群抽样。研究选取健康体检的成年人1 069例(男性364 例，女性705 例)，均为汉族，年龄20～59 岁，籍贯为贵州地区常驻居民(≥5年)。身体发育成熟，Tanner V 期;无先天性发育异常或后天性器质性畸形;无身高缺陷或影响骨代谢的各种急慢性疾病;无血液系统疾病、甲状腺疾病、垂体疾病和肿瘤病史;无遗传性疾病;BMI(18.5～24 kg/m2)、糖脂代谢、肝肾功能和血压等指标正常;除外精神障碍及不能完成问卷调查者。本研究已经中国医学科学院基础学院伦理委员会批准，所有研究者均签署知情同意书。

1.1.2 问卷调查:1)一般情况调查:人口学指标、生活习惯和疾病遗传史等;2)健康生活方式和行为现况调查:体育锻炼、饮食习惯和生活方式等。

1.1.3 体格检查:身高、坐高、体质量、身体成分和血压等。

身高由专门的医护人员使用标准身高计按人体测量的标准方法测量收集［4］:受试者赤脚、呈立正姿势站在身高计的底板上，躯干挺直，脚跟、骶骨部及两肩胛间与身高计的立柱接触，两眼平视前方，耳屏上缘与眼眶下缘最低点呈水平，重复测量3 次并记录均值。体质量、BMI 由百利达BC-420 人体成分测试仪(Tanita，上海百利达商贸有限公司)测定。

1.1.4 标本收集:清晨空腹抽取肘静脉血6 mL，其中EDTA 抗凝试管4 mL(2 mL/管)，用于基因组DNA提取和血常规检测;普通血清管2 mL，3 000 r/min 离心10 min，分装2 份至保存管，用于生化指标检测。以上标本置于－20 ℃冰箱冷冻保存。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA 提取:用RelaxGene Blood DNA System 血液基因组DNA 提取系统试剂盒(DP319，北京天根生化科技有限公司)提取基因组DNA。简要操作步骤如下:取2 mL 全血，加入细胞裂解液CL、FG 缓冲液和蛋白酶K 混合液，充分裂解血细胞，经异丙醇及无水乙醇沉淀、离心、缓冲液洗脱后，加入100 μL 缓冲液TB，放置4 ℃冰箱。

1.2.2 DNA 浓度标准化及凝胶电泳检测:Nanodrop 2000(Thermo Scientific 公司)测定样本基因组DNA浓度及A 值(A260/280介于1.7～2.0)，并将DNA 质量浓度标准化为15～20 ng/μL。将上述基因组DNA行1.5%琼脂糖凝胶电泳，120 V 30 min，溴化乙锭(EB)染色后，紫外灯下观察条带(图1)。

图1 全基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳Fig 1 Agarose gel electrophoresis of whole-genome DNA

1.2.3 引物设计与合成:根据NCBI 提供的SNP 位点序列信息，使用Sequenom 公司的引物设计软件Assay Design3.1 设计PCR 反应和单碱基扩增引物，由上海赛百胜基因技术有限公司进行合成。

1.2.4 扩增反应:PCR 扩增过程:94 ℃预变性15 min;94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45 个循环后，72 ℃延伸3 min。使用SAP 酶(虾碱磷酸酶+核酸外切酶)消化PCR 产物，然后加入单碱基扩增引物进行延伸反应。

1.2.5 SNPs 检测:用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)方法检测等位基因，Sequenom MassArray 系统(MassARRAY Analyzer 4)进行基因分型。简要操作步骤如下:1)将上述扩增反应产物进行稀释，使用树脂进行脱盐;2)将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶;3)上机进行质谱检测，并收集数据。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 连锁不平衡检验

本研究1 069 例汉族成年人的一般情况见表1。本研究中GDF5 基因rs143383、rs143384、rs6060369和rs224331 位点经Hardy-Weinberg 平衡检验，均符合H-W 平衡定律(P ＞0.05)，具有群体代表性。

表1 贵州地区1 069 例汉族成年人一般情况Table 1 Characteristics of 1 069 Han participants in Guizhou province(±s)

表1 贵州地区1 069 例汉族成年人一般情况Table 1 Characteristics of 1 069 Han participants in Guizhou province(±s)

1 mmHg=0.133 kPa.

gendermale(n=364)female(n=705)total(n=1069)age/years41.1 ±9.840.1 ±10.240.5 ±10.1 height/cm165.6 ± 5.8153.6 ± 5.4157.7 ± 7.9 BMI/(kg/m2)22.03 ±1.7521.72 ±1.7121.83 ±1.72 SBP/mmHg125 ± 15119 ± 17121 ± 17 DBP/mmHg77 ±1173 ±1175 ±11 HR/(beats/min)77 ±1179 ±1079 ±10 FBG/(mmol/L) 4.77 ±0.554.77 ±0.454.77 ±0.49 HGB/(g/L)162 ± 12139 ±12147 ±16 AST/(U/L)25.01 ±9.6120.63 ±6.9622.13 ±8.23 ALT/(U/L)21.46 ±12.93 13.44 ±7.2516.17 ±10.30 BUN/(mmol/L) 4.82 ±1.034.22 ±1.114.43 ±1.12 Cr/(μmol/L)82.41 ±11.29 60.81 ±8.9968.16 ±14.19 TC/(mmol/L)4.75 ±0.884.72 ±0.914.73 ±0.90 TG/(mmol/L)1.67 ±1.361.29 ±1.021.42 ±1.16 HDL-C/(mmol/L) 1.39 ±0.321.53 ±0.301.49 ±0.31 LDL-C/(mmol/L)2.72 ±0.772.64 ±0.722.67 ±0.74

2.2 GDF5 基因SNPs 与身高的相关性分析

男性和女性身高均呈正态分布。女性组中，GDF5 基因rs143383 位点存在GG、AG 和AA 3 种基因型，其中GG 基因型个体的平均身高最高，分别高出AG 基因型个体和AA 基因型个体1.7 cm(P＜0.01)和2.3 cm (P＜0.05);GDF5 基因rs143384 位点GG 基因型个体的平均身高分别高出AG 基因型个体和AA 基因型个体1.6 cm(P＜0.05)和2.1 cm(P＜0.01);GDF5 基因rs6060369 位点CC、CT、TT 3种基因型个体中，CC 基因型的平均身高最高，为(155.5 ±5.2)cm，分别高出CT 基因型个体和TT基因型个体1.7 cm(P＜0.05)和2.2 cm(P＜0.01);GDF5 基因rs224331 位点CC、CA、AA 基因型间身高均值存在差异(P＜0.05)(表2)。

男性组中，各位点基因型间身高均值无显著性差异，基因型分布与身高无明显相关性。

2.3 GDF5 基因SNPs 对身高的贡献效应

以身高为因变量，各研究位点基因型多态性为自变量，分别进行线性回归分析。结果显示，女性组中，GDF5 基因rs224331、rs6060369、rs143383 和rs143384 位点基因型多态性与身高显著相关(P＜0.05)，4 个位点可分别解释身高变异的1.4%、0.9%、1.1% 和1.0% (表3)。

表2 贵州汉族人群GDF5 基因SNPs 与女性身高的相关性分析Table 2 The association between GDF5 gene single nucleotide polymorphisms and women's height in Guizhou Han population(±s)

表2 贵州汉族人群GDF5 基因SNPs 与女性身高的相关性分析Table 2 The association between GDF5 gene single nucleotide polymorphisms and women's height in Guizhou Han population(±s)

SNPgenotypeNheight/cm rs143383AA342153.2 ±5.5 AG289153.8 ±5.4 GG66155.5 ±5.1 rs143384AA341153.2 ±5.5 AG292153.8 ±5.4 GG66155.3 ±5.3 rs224331AA237153.4 ±5.3 CA125154.5 ±5.5 CC28155.5 ±5.0 rs6060369TT352153.3 ±5.5 CT286153.7 ±5.3 CC60155.5 ±5.2

表3 GDF5 基因SNPs 与贵州地区汉族女性身高的线性回归分析Table 3 Linear regression analysis of the association between GDF5 gene single nucleotide polymorphisms and women's height in Guizhou Han population

3 讨论

身高受遗传和环境等因素的影响，有研究估测SNP 可解释45%的身高表型［5］，但每个SNP 的基因变异对身高的影响很小，通常以联合效应的形式影响个体身高。目前已发现180 个身高相关SNPs，总体可解释10%的身高变异［6］。国内外多篇文献报道了SNPs 与身高的相关性［7-9］。

本研究结合GWAS 研究数据及相关报道，选择GDF5 基因rs143383、rs143384、rs6060369 和rs224331位点，对贵州地区1 069 例汉族个体身高进行关联性分析。结果在成年女性中发现，GDF5 基因rs6060369 位点CC 基因型个体的平均身高最高;与本结果相似，芬兰对6 114 人的GWAS 研究显示，GDF5 基因rs6060369 位点的C 等位基因可使身高增加0.3～0.7 cm［10］。本研究还发现，GDF5基因rs143383、rs143384 均为携带GG 基因型个体的平均身高最高;荷兰鹿特丹市6 365 人的人群研究也发现，GDF5 基因rs143383 位点与女性身高相关［11］。另外，8 184 名欧洲裔美国儿童的研究发现GDF5 基因rs4911494 位点也与身高相关［12］。本研究进一步的线性回归分析发现，GDF5 基因SNPs 可影响女性身高。

生长分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF5)基因定位于20 q11.2，是调控肢体软骨形成、骨骼发育的重要因子［13］，编码GDF5 骨形态发生蛋白。本研究的rs143383、rs143384、rs224331 和rs6060369 身高相关SNPs 位点分别位于GDF5 基因的外显子区、启动子区、5'UTR 以及内含子区。以上SNPs 可能通过作用于基因转录、翻译及剪切等过程而影响个体的骨骼发育并引起身高差异的形成。

本研究还发现，尽管GDF5 基因SNPs 与女性身高显著相关，但是与男性身高无明显相关性。提示GDF5 基因SNPs 对身高的影响可能存在性别差异。雌激素具有促进骨形成的作用，它可通过促进转化生长因子-β(TGF-β)超家族的骨形态发生蛋白2(BMP2)基因的转录，从而促进骨形成［14］。因为GDF5 与BMP2 均为骨形态发生蛋白家族的成员，结构和功能上存在相似性，所以推测GDF5 基因表达可能与雌激素水平相关，从而导致男女在GDF5 基因SNPs 和身高的相关性上呈现差异。荷兰鹿特丹市6 365 人的人群研究也发现GDF5 基因rs143383 位点与女性身高相关［11］，与本研究相一致。此外，本研究中男女例数差异也可能对结果产生影响。

总之，本研究验证了GDF5 基因SNPs (rs143383、rs143384、rs224331 和rs6060369)与女性身高的相关性，GDF5 基因可能是影响中国汉族成人女性身高个体差异的基因。GDF5 基因影响人类身高的具体机制如何，是否存在种族、地域及性别差异等问题，还需要进一步探索。

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