动脉移植BMSCs对脊髓缺血再灌注损伤大鼠脊髓细胞凋亡和caspase－9基因的影响

陈珊珊，金 华

(1.楚雄医药高等专科学校外科教研室，云南楚雄675000;2.云南省第一人民医院麻醉科，云南昆明650031)

脊柱创伤、肿瘤、血管疾病及手术等引起脊髓局部神经细胞因缺血缺氧发生中心性坏死，当恢复血流灌注后，局部缺血组织继而出现一系列继发性损害，导致损伤平面以下神经功能丧失，称为脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemic reperfusion injury，SCIRI)。以往的研究认为缺血再灌注时细胞的死亡方式为坏死，但近年来发现，细胞凋亡可能是其发病机制中的重要环节之一［1］，细胞凋亡分子机制研究发现caspase、Fas、Bcl－2 等［2］多种基因参与细胞凋亡，其中caspase 家族蛋白酶的激活是细胞凋亡发生的最关键环节［3］，caspase－9 属于该家族的重要成员之一，是细胞内凋亡调控途径即线粒体途径中的重要组成部分。骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向神经元细胞分化潜能、来源广泛、取材容易、免疫排斥反应弱等优点，是目前用于脊髓损伤治疗的有用干细胞［4］。本研究小组先前在完成动脉移植BMSCs 治疗SCIRI大鼠模型建立［5］的基础上，发现经肾下腹主动脉移BMSCs 能明显减轻SCIRI 大鼠缺血节段脊髓神经元坏死，并促进上下行神经纤维再生［6］，因而BMSCs移植有望成为一种有效治疗SCIRI 的新方法。本研究采用经肾下腹主动脉移植BMSCs，避免了脊髓局部注射途径的“二次损伤”和外周静脉注射的“循环消耗”等缺点，同时具有微创、操作简便、定位准确和分布均匀等优点。通过观察移植后动物行为学功能、脊髓细胞凋亡和caspase－9 表达变化，探讨经肾下腹主动脉移植BMSCs 改善SCIRI 大鼠脊髓功能的另一可能的凋亡机制，为BMSCs 移植治疗SCIRI提供更有利的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD 大鼠40 只，其中雌性大鼠24 只，质量200～220 g;幼年大鼠16 只，雌雄不限，体质量30～40 g(昆明医科大学实验动物科，合格证号:SYXK 滇2005－2004)。

1.2 主要试剂

DMEM/F12 培养液和胎牛血清(Hyclone 公司);小鼠抗大鼠CD44(Chimecon 公司);PV－9000 二步法免疫组化试剂盒和DAB 显色试剂盒(中山金桥生物技术公司);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒和PCR 试剂盒(Fermentas 公司);TUNEL试剂盒(Roche 公司)，小鼠抗大鼠caspase－9(Chemicon 公司)，小鼠抗大鼠β－actin 和HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 二抗(Stanta Cruz 公司)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs 体外培养与鉴定:脱颈椎法处死幼年大鼠，浸泡于75%乙醇溶液中浸泡消毒2～3 min，转入超净工作台，无菌条件下剥离出双侧股骨骨髓腔内骨髓用于培养BMSCs，培养至第3 代细胞用于CD44 免疫染色，具体方法参见本研究小组先前完成的肾下腹主动脉移植骨髓间充质干细胞治疗脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型的建立［5］。

1.3.2 动物分组与模型制备:将大鼠随机分为假手术组(sham group)、缺血再灌注组(ischemic reperfusion group，I/R)和移植组(BMSC group)，每组8只。动物模型制备在本研究小组先前建立的大鼠脊髓缺血再灌注损伤改良模型［7］基础上完成，假手术组仅行手术操作;缺血再灌注组阻断肾下腹主动脉120 min 后开放，恢复脊髓再灌注5 min 后经动脉留置套管针缓慢推注10% FBS 1 mL;移植组手术操作与缺血再灌注组相同，向套管针内推注1 mL BMSCs悬液(1 ×106cell/mL)。术毕认真检查手术部位，没有渗血后逐层缝合。所有术后大鼠每天腹腔注射青霉素20 万U 预防感染，对于术后截瘫的动物，每天早晚按摩膀胱排尿，必要时给予开塞露排便。

1.3.3 神经行为学评价:采用Basso 等［8］提出的BBB 评分体系于术后1、3 和7 d 对所有大鼠进行行为学评估，包括0～21 级，完全功能缺失为0 分，完全正常鼠为21 分，评价的内容主要包括大鼠后肢的运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙以及尾的位置等。由3 位熟悉评分标准的非本组实验人员评分，取平均值。

1.3.4 标本采集和处理:术后7 d 对实验动物取材，截取L1、L2 脊髓分别用于RT－PCR 和Western blot，并快速转入－80 ℃冰箱保存备用。截取L3 节段脊髓置于4% 多聚甲醛内作后固定，先后置于15%和30%梯度蔗糖液内脱水，石蜡包埋，连续切片(片厚4 μm)，贴片后37 ℃烤干备用。

1.3.5 RT－PCR 检测脊髓caspase－9 mRNA 表达:应用PubMed 查找SD 大鼠caspase－9 和内参β－actin 的mRNA 序列，利用Premier 5.0 软件设计引物序列。caspase－9 引物上游序列为5'－CCACTGCCTCATCAT CAACA－3'，下游序列为5' －CCTGGTATGGGACAGCA TCT－3'，扩增产物479 bp。β－actin 引物上游序列为5'－GTAAAGACCTCTATGCCAACA－3'，下游序列为5'－GGACTCATCGTACTCCTGCT－3'，扩增产物227 bp。引物由大连宝生物工程公司合成。

取出冻存的L1 脊髓，Trizol 裂解，三氯甲烷萃取提取总RNA。紫外分光光度法及甲醛变性凝胶电泳鉴定提取RNA 的纯度和完整性。按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书合成cDNA。按照PCR Master Mix Kit 说明书操作，以上述cDNA 第一链为模板进行聚合酶链反应扩增。

PCR 产物以1%琼脂糖凝胶电泳分析，采用1∶20 000 GoldView 显色，1% TAE 为电极缓冲液，DL－2000 DNA Marker 为电泳条带对照，180 V 电泳20 min。凝胶成像仪成像观察电泳带及其位置，对照Marker 比较扩增产物的大小并对电泳条带进行吸光度分析，计算caspase－9 PCR 产物与β－actin PCR 产物的吸光度比值。

1.3.6 Western blot 检测脊髓caspase－9 蛋白的表达:取出冻存的L2 脊髓，蛋白裂解液裂解，玻璃匀浆器机械匀浆、静止、离心提取蛋白上清液并测定蛋白浓度;采用15%分离胶进行电泳，电泳条件设置为:180 V、100 mA、55 min;在100 V、350 mA、90 min条件下电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜;10%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，将膜封入含caspase－9 抗体(1∶500)塑料袋内，置摇床上孵育70 min，采用β－actin 抗体(1∶2 000)作为内对照;洗膜后于室温下将膜封入HRP 标记的二抗(1∶5 000)内，置摇床上孵育70 min;常规洗膜后采用增加化学发光(ECL)试剂盒显影曝光成像，采集图片，利用Quantity One 软件测定阳性条带的吸光度值，与相应β－actin吸光度值比较，对特异性caspase－9 蛋白条带进行半定量分析。

1.3.7 TUNEL 检测细胞凋亡:组织切片脱蜡后，滴加2 μg/mL 蛋白酶K，37 ℃消化30 min;双蒸水漂洗样片后浸入TdT 缓冲液(30 mmol/L Trizma 基础液，pH 7.2，140 mmol/L 磷酸氢钠二甲胂酸盐，1 mmol/L CoCl2)，再孵育于TUNEL 反应液(1 液1 μL，2 液9 μL)，37 ℃标记1 h 后转入4 ℃过夜;用0.01 mol/L PBS 漂洗，滴加碱性磷酸酶，再用PBS漂洗;将样片置于碱性磷酸酶显色底物NBT/BCIP液中避光显色5～10 min，随后用双蒸水终止反应。同时做对照试验，TUNEL 反应液中不加TdT 酶(1 液)。常规脱水、透明，中性树胶封固。显微镜观察并采集图片，每张计算3 个200 倍视野后取平均数。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 BMSCs 生长情况及CD44 染色结果

图1 BMSCs 体外培养及CD44 鉴定Fig 1 BMSCs cultured in vitro and identified with CD44 (×200)

接种2～3 d，镜下可见细胞多以圆形贴壁生长，但贴壁尚不稳固，少数细胞胞体呈索形;培养4～5 d，可见绝大多数细胞胞体两端长出突起，突起较短，胞体呈索形或三角形;培养7 d，细胞形态、极性较为一致，胞体较前扁平，突起较短，呈漩涡状生长且基本覆盖满板底(图1A)。培养至第3 代的BMSCs胞体扁平呈索形或三角形，细胞突起较短。CD44免疫细胞化学染色可见大量细胞被染为棕色，胞质和突起着色，胞核不着色，呈圆形或椭圆形，以椭圆形为主(图1B)。

2.2 神经行为学评分(BBB 评分)

SCIRI 大鼠(缺血再灌注组和移植组)术后存在严重功能障碍，各时间点BBB 评分显著低于假手术组(P＜0.01)，大鼠后肢功能随时间延长出现不同程度的恢复，BBB 评分较同组前一时间点增加(P＜0.01)，其中移植组术后3、7 d BBB 评分高于缺血再灌注组(P＜0.01)(表1)。

表1 3 组大鼠术后不同时刻BBB 评分比较Table 1 BBB scores in three groups of rats(±s，n=8)

表1 3 组大鼠术后不同时刻BBB 评分比较Table 1 BBB scores in three groups of rats(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with sham group;#P＜0.01 compared with I/R group.

group1 day after operation 3 days after operation 7 days after operation sham19.8 ±1.420.6 ±1.021.0 ±0 I/R0.8 ±0.3*2.5 ±0.6*4.1 ±1.4*BMSC0.9 ±0.3*5.2 ±1.2* #7.7 ±1.6*#

2.3 Caspase-9 mRNA 和蛋白表达变化

术后7 d，3 组大鼠脊髓样本均能检测到caspase－9 mRNA 和蛋白表达。与假手术组比较，缺血再灌注组和移植组caspase－9 mRNA 和蛋白的表达水平均增高(P＜0.01)，而移植组的表达水平低于缺血再灌注组(P＜0.01)(图2)。

2.4 脊髓细胞凋亡情况

术后7 d，假手术组L3 脊髓内无TUNEL 阳性产物，缺血再灌注组和移植组可见大量核被染为蓝紫色的凋亡细胞，细胞形态不一，细胞核固缩，有的呈碎片状，大小不一致，核内散在分布蓝紫色颗粒，核膜完整或不完整，并可见凋亡小体分布。移植组凋亡细胞数(10.0 ± 2.3)较缺血再灌注组(23.0 ±4.8)减少(P＜0.01)(图3)。

3 讨论

本研究中TUNEL 检测和BBB 评分显示，与I/R组相比，SCIRI 术后7d BMSCs 移植组大鼠脊髓内凋亡细胞数明显减少，BBB 评分显著增高。提示SCIRI 诱导了损伤脊髓神经元和胶质细胞发生凋亡，表现为动物后肢功能严重障碍，而肾下腹主动脉移植BMSCs 则能够减轻损伤脊髓细胞凋亡的程度，进而改善大鼠后肢功能恢复。

图2 3 组大鼠术后7 d 脊髓β-actin 和caspase-9 mRNA 及蛋白表达变化Fig 2 The expression change of β-actin and caspase-9 mRNA and protein in spinal cord of rats in three groups at 7 days post operation

图3 3 组大鼠术后7 d L3 脊髓TUNEL 染色Fig 3 The TUNEL staining in spinal cord of rats in three groups at 7 days post operation (×200)

既往关于细胞凋亡分子机制的研究发现caspase 家族介导的细胞内凋亡调控途径中，内源性通路主要是线粒体细胞色素C 释放入胞质［9］，与凋亡蛋白酶激活因子和caspase－9 前体结合，使caspase－9 酶原活化，从而激活下游的效应蛋白caspase－3，活化的caspase－3 既可通过激活底物caspase－6 和caspase－7，共同参与降解底物，也可直接降解下游底物，降解染色体DNA，使DNA 片段化，最终导致细胞凋亡。本研究发现I/R 组和BMSCs 移植组大鼠脊髓caspase－9 mRNA 和蛋白表达水平较假手术组显著增加，而移植组表达水平较I/R 组减少。结合上述脊髓凋亡形态学和动物行为学结果，说明SCIRI 激活了脊髓caspase 家族蛋白酶，表现为caspase－9 基因和蛋白的表达增加，诱导脊髓细胞凋亡，表现大鼠后肢功能严重障碍;而经肾下腹主动脉输注的BMSCs 能够有效抑制SCIRI 大鼠脊髓caspase－9 的表达，减轻脊髓细胞凋亡，改善大鼠后肢功能恢复，提示动脉移植BMSCs 可能通过下调SCIRI 后大鼠脊髓内源性通路的细胞凋亡相关蛋白caspase－9 表达来抑制细胞内凋亡调控途径，从而减轻损伤脊髓神经元和胶质细胞凋亡，进而改善了SCIRI 大鼠后肢功能。

BMSCs 除具有干细胞自我更新和多向分化潜能的共性外，还具有分泌血管内皮生长因子(VEGF)等神经营养因子发挥神经保护作用［10］，有研究发现VEGF 可能通过抑制caspase－3 表达减少家兔脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的发生［11］，三七总皂甙可能通过抑制Fas/FasL 系统的激活，减少caspase－3 表达，阻遏肺组织细胞凋亡，从而减轻肺缺血再灌注损伤［12］，因此BMSCs 是否是通过分泌神经营养因子发挥神经保护作用的同时，调节损伤脊髓内caspase－9 表达来抑制细胞内凋亡调控途径?亦或通过外源性通路上的caspase－8，或进而激活的caspase－3 来发挥抗凋亡的作用?目前仍不得而知，这正是本研究组接下来的研究方向，以进一步明确BMSCs 移植治疗脊髓损伤的抗凋亡的分子通路。

综上所述，肾下腹主动脉移植BMSCs 能够抑制缺血再灌注损伤脊髓caspase－9 表达，减轻脊髓局部细胞凋亡，进而促进SCIRI 大鼠脊髓神经功能恢复。本研究为临床治疗脊髓损伤提供了一条新的途径，为进一步研究BMSCs 移植治疗脊髓损伤的机制提供了实验依据。

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