HLA-DQ遗传多态性与乙肝病毒感染结局相关

侯思慧，李青岭，胡 筠，彭 洪，郭进军*

(1.重庆医科大学附属第二医院消化内科，重庆400010;2.重庆医科大学生命科学研究院，重庆400016)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起中国近10%的感染率［1］。慢性HBV 感染的临床表现和转归显著异质化，约半数以上患者病情稳定，表现为无症状携带或轻度慢性肝炎;部分患者则预后不良，可进展为肝硬化或肝癌等终末期肝病［2］。HBV感染的不同结局通常归因为宿主、病毒自身及环境3 大因素，越来越多的证据表明宿主遗传因素在HBV 感染中发挥了举足轻重的作用［3-5］。

人类白细胞抗原(HLA)在调节HBV 感染的免疫应答和临床转归上起到了重要作用［6-8］。近来，全基因组关联分析表明在日本人中HLA-DQ rs9275572 与丙肝相关肝癌发生密切相关［9］。随后，研究发现HLA-DQ rs9275319 影响乙肝相关肝癌的发生［10］。因此，本研究通过病例-对照方法来探讨HLA-DQ 基因多态性(rs9275572 和rs9275319)与乙型肝炎病毒感染结局的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集从2011年1月至2014年6月门诊就诊于重庆医科大学附属第一医院及附属第二医院的310名HBV 相关慢性肝病者(CLD)，其中CLD 包括慢性乙型肝炎(CHB)、乙肝肝硬化(LC)、乙肝肝癌(HCC)。同时收集在体检科进行健康查体的295名HBV 自发清除者(SC)及316 名健康对照者(HC)。所有受试者均无血缘关系。在样本收集中，无性别、年龄限制。各组纳入标准参照表1。

具备下列之一须排除:1)HIV 或非HBV 肝炎病毒感染者;2)乙肝两对半不明确;3)仅有HBsAb(+)的疫苗接种者;4)其他肝脏疾病:如自身免疫型肝病，毒性因素所致的肝病等;5)严重的系统性疾病如系统性红斑狼疮等;6)非汉族人。本研究通过了重庆医科大学附属第二医院医学伦理委员会的批准，且所有的受试者均签署了以赫尔辛基宣言为基础的书面知情同意书。

1.2 样本采集及生化酶学指标

采集每个受试者血液3～5 mL，于－80 ℃保存以备用。通过问卷调查记录其年龄、性别、饮酒和吸烟等基本情况。两对半、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清总胆红素(T-Bil)及HBV-DNA 的测定由本医院检验科完成。

表1 各组筛选标准Table 1 Diagnosis criteria for all groups

1.3 基因组DNA 的提取及基因分型

外周血基因组DNA 的提取按照Wizard® Genomic DNA 纯化试剂盒(Promega 公司)说明完成。NanoDrop 2000 (Thermo Scientific 公司)测定DNA浓度，并稀释成20 ng/μL备用。

单核甘酸多态性(SNP)rs9275572 和rs9275319分型采用TaqMan 探针法(Applied Biosystems 公司)。TaqMan 等位基因鉴别实验由ABI 7500 fast real-time PCR system 完成(Applied Biosystems 公司)，其中每96 孔设置1 个阴性对照和1 个阳性对照。PCR 扩增反应体系为20 μL，含20 ng/μL DNA 2 μL，master mix 10 μL，primer-probe mix 0.5 μL 及DNAase-free water 7.5 μL。PCR 反应条件参照TaqMan 探针说明书。为保证分型准确，随机选取5%样本用同一方法重复验证，基因分型错误率小于＜0.1%。

1.4 统计学分析

数据分析由SPSS19.0 软件完成。Student t 检验或Mann-Whitney U 检验用于计量资料的比较;χ2检验用于计数资料比较;二分类logic 回归校正年龄性别后比较基因型及基因模型在各组中的差异。Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡由Stata 20.0 软件完成。单体型分析由Haploview software (v4.2)软件完成。所有检验P 值均为双侧。

2 结果

2.1 基本资料及Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡

2.1.1 基本资料:在男性，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、胆红素(T-Bil)、HBV-DNA 定量上，CLD 组显著高于SC 及HC 组(P＜0.001)(表2)。

2.1.2 Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡:rs9275572、rs9275319 均符合 H-W 遗传平衡(CLD 组:rs9275572 位点P = 0.158，rs9275319 位点P =0.285;SC 组:rs9275572 位点P =0.729，rs9275319位点P =0.182;HC 组:rs9275572 位点P =0.513，rs9275319 位点P=0.238)。

2.2 HLA-DQ rs9275572 基因型与乙肝感染结局的关系

rs9275572 GG 型是各组中最常见基因型。携带rs9275572 AG 基因型有利于感染后病毒的自发清除，这种保护性作用在显性遗传模型中仍存在(基因型:OR 1.82;95% CI 1.26～2.62，校正后P＜0.001;显性模型:OR 1.84;95% CI 1.30～2.61，校正后P＜0.001)(表3)。

2.3 HLA-DQ rs9275319 基因型与乙肝感染结局的关系

携带rs9275319 TC 型降低了乙肝感染的风险(CLD vs HC:基因型:OR 0.48;95% CI 0.31～0.76;显性模型:OR 0.47;95% CI 0.31～0.72)。尽管其3 种基因型在探讨乙肝病毒感染后自发清除方面未表现出相关性，但对等位基因频率及显性模型分析时发现C 等位基因及TC+CC 型有利于病毒感染后清除(等位基因:OR 1.61;95% CI 1.06～2.43;显性模型:OR 1.57;95% CI，1.01～2.48)(表3)。

2.4 HLA-DQ 基因单体型与乙肝病毒感染结局的关系

考虑到单体型在解释多态性与疾病相关性上有更好的说服力，本研究以HLA-DQ 两位点为基础构建单体型，两位点连锁不平衡(图1)。单体型T-G和T-A 与乙肝易感性及乙肝病毒感染后自发清除有关(CLD vs HC:单体型T-G P＜0.01/单体型T-A P＜0.05 ;CLD vs SC:单体型T-G P＜0.001/单体型T-A P＜0.01)。在疾病进展方面，未发现与其有关的单体型(表4)。

表2 纳入研究者的人口学及临床特征Table 2 Demographic and clinical characteristics of the subjects enrolled in the study

3 讨论

图1 HLA-DQ 基因两位点连锁不平衡Fig 1 Linkage disequilibrium (LD)of the two SNPs in HLA-DQ gene

表3 HLA-DQ 基因型与乙肝感染结局的关系Table 3 Effects of HLA-DQ genotypes on HBV infection outcomes

表4 HLA-DQ 单体型与乙肝感染结局的关系Table 4 Association of HLA-DQ Haplotypes with the outcomes of HBV infection

人类白细胞抗原(HLA)作为人类复杂性最高的基因，在病毒感染性疾病中起重要作用［9-12］。HLA位于第6 号染色体短臂(6p21.3)，长约4 Mb，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因，其中HLA-DQ 作为Ⅱ类基因，由34 ku α 链和28 ku β 链非共价结合而成，主要通过CD4+T 细胞识别HLA-Ⅱ类分子呈递的抗原肽复合物，从而激活抗原特异性B 细胞及细胞毒性T 细胞(CTL)，参与抗HBV 的免疫应答［13］。rs9275572位于HLA-DQA 和HLA-DQB 基因间，以参考文献［9］研究为基础，同时考虑到乙肝病毒与丙肝病毒感染后引起类似免疫反应机制，许多与丙肝有关的基因多态性位点经研究在乙肝免疫反应中同样起作用［11，14］，本研究试图探索rs9275572 是否与乙肝感染结局存在相关性。令人兴奋的是，本研究发现携带rs9275572 AG +AA 基因型有利于感染后病毒的自发清除，其得到了同一时段内其他相关研究的支持［6-7］。HLA-DQ rs9275319 相距rs9275572 约12 kb，本研究发现rs9275319 C 等位基因可减少HBV感染，其与Jiang DK 等［10］全基因组关联研究(GWAS)一致，另一个重要发现为携带rs9275319 TC +CC 型有利于病毒感染后自发清除。两位点单倍体分析进一步佐证了上述观点。

本研究将rs9275572 与rs9275319 结合探讨HLA-DQ 基因多态性与乙肝感染结局的关系。然而，对于rs9275572 来说，本研究较之其他研究仍有相悖之处，2011年GWAS 研究结果表明其对HCV-肝癌有影响［9］，而在本实验中未能发现其与乙肝疾病进展的关系，考虑存在以下原因:1)虽然在免疫反应及临床表现上乙肝与丙肝类似，但乙肝病毒是dsDNA 病毒，而丙肝病毒是单股正链RNA 病毒，有研究表明在双重感染中，HBV 和HCV 有相互抑制的趋势［15］，这可能会导致rs9275572 位点在乙肝肝癌和丙肝肝癌研究中的差异。2)SNP 在不同人种、不同区域遗传差异显著，这也是导致该研究与其他研究差异的一个原因。本研究也存在一定的不足之处，即纳入研究的样本数目不够大，尤其在探讨疾病进展方面，这在一定程度上降低了实验信度。今后需要样本更大、设计更严谨的实验来验证本发现。总之，本研究表明中国人HLA-DQ 基因多态性与乙肝易感性及感染后病毒自发清除有关，这在一定程度上为慢性乙型肝炎的早预防和高应答率治疗奠定了些许基础。

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