FGF－23（R176Q）过表达对成年小鼠下颌骨形成和矿化的影响＊

刘 洪，孙 雯，郑阳玉

（1．盐城卫生职业技术学院口腔医学技术教研室，江苏盐城224005；2．南京医科大学解剖学系 210029；3．南京医科大学口腔医学研究所 210029）

常染色体显性遗传低磷性佝偻病（autosomal－dominant hypophosphatemic rickets，ADHR）［1］是一种常见的佝偻病。导致ADHR的主要原因在于FGF－23（R176Q）错义突变后无法被蛋白水解酶水解，导致FGF－23在体内蓄积，肾脏磷酸盐回收不足导致磷酸盐尿，肾脏1－羟化酶（1－alpha－hydroxylase，1－ase）的合成被抑制，1，25（OH）2D3合成减少［2］。利用转基因的手段将错义突变的人FGF－23基因转入小鼠，构建ADHR的小鼠动物模型FGF－23（R176Q）转基因小鼠。表型分析发现，FGF－23（R176Q）转基因小鼠表现出发育缓慢、肌张力降低、手足搐搦、囟门闭合不全等佝偻病的症状，与ADHR患者的症状基本一致［3］。但是，FGF－23（R176Q）过表达对下颌骨的形成、矿化是否有影响，目前，未见有相关报道。本研究利用8周龄的FGF－23（R176Q）转基因小鼠和同窝的野生型小鼠，通过X线扫描、组织学等手段进行观察，试图阐明FGF－23（R176Q）对小鼠下颌骨形成和矿化是否有影响以及作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物 选用同窝的8周龄野生型（wild type，WT）小鼠和FGF－23（R176Q）转基因小鼠各15只，雌雄不限，饲养于无特殊病原体级动物房，使用常规饮食（1．0%钙，0．5%磷）进行饲养。

1．2 动物基因型鉴定及分组 剪取1mm长鼠尾，使用酚－氯仿－异戊醇法进行DNA的提取，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）进行小鼠基因型的鉴定。PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物进行凝胶电泳，在紫外灯下进行观察。根据基因型的结果分为TG组和WT组，PCR电泳结果有436bp条带者为FGF－23（R176Q）小鼠，无条带者为 WT小鼠［4］。

1．3 血清学检查 小鼠使用乙醚进行麻醉，麻醉后固定于动物台上，使用1mL注射器进行心脏采血，4℃下以2 000 r／min离心10min，抽取上层血清，使用放射免疫法进行血清钙、磷和1，25（OH）2D3浓度检测。

1．4 取材 解剖分离小鼠的左侧下颌骨并免疫电镜固定液固定，采用乙二胺四乙酸（EDTA）法脱钙2周，脱水包埋，按照下颌第1磨牙近中根根管方向对下颌骨进行横断面切片，切片厚度5μm。解剖分离小鼠的左侧下颌骨，使用75%乙醇固定，进行CT检查。

1．5 CT检查 使用SkyScan 1072scanner扫描仪对75%乙醇固定的小鼠下颌骨进行扫描检查，扫描电压100kV，电流98 mA，通过CT检查观察两组小鼠的下颌骨骨密度变化情况。

1．6 染色观察

1．6．1 总胶原染色 石蜡切片脱蜡水化，用配制好的苦味酸直红染色液孵育1h，流水冲洗5min，苏木精染色10min，梯度乙醇脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1．6．2 二聚糖免疫组织化学染色 石蜡切片使常规脱蜡水化，用5%正常兔血清封闭20min，分别加入羊抗鼠二聚糖一抗（1∶500，美国Santa Cruz公司），4℃孵育过夜，PBST清洗，加兔抗羊IgG二抗（1∶200，美国Sigma公司），室温孵育30 min；PBST清洗，加Elite－ABC（英国Vector公司）孵育30min，PBS清洗，加DAB溶液（英国Vector公司）室温避光孵育5～8 min，苏木精复染1min，常规脱水透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察摄片，计算聚糖在下颌骨中的阳性面积比例。

1．6．3 HE染色 石蜡切片使常规脱蜡水化，苏木素染色10 min，流水冲洗后使用伊红染色30s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下测量2种不同基因型小鼠下颌骨成骨细胞密度（Ob．s／B．Pm）。

1．7 骨钙素（osteocalcin，OCN）和Ⅰ型胶原mRNA表达水平检测 解剖小鼠的下颌磨牙，一步法提取总RNA，常规方法进行逆转录，利用real time RT－PCR方法检测下颌骨的OCN和Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen）基因的表达水平。OCN正向引物序列为：5′－CAA GTC CCA CAC AGC AGC TT－3′，反向引物序列为：5′－AAA GCC GAG CTG CCA GAG TT－3′，产 物 370 bp，Ⅰ型胶原正向引物序列为：5′－TCT CCA CTC TTC TAG TTC CT－3′，反向引物序列为：5′－TTG GGT CAT TTC CAC ATG C－3′，产物269bp，使用 Applied biosystems 7300型实时定量RT－PCR仪扩增并进行统计分析实验结果，以WT组的表达量作为参照。

1．8 统计学处理 采用SPSS13．0统计学软件进行分析，组间单因素方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 血清学指标检查 WT组小鼠血清钙、磷和1，25（OH）2D3浓度均明显高于TG组，而WT组的PTH的浓度低于TG组，差异有统计学意义（P＜0．05），见表1。

表1 两组小鼠血清学指标检查（x±s）

2．2 CT检查结果 CT的检查结果显示，而TG组颌骨X线阻射程度低于WT组小鼠，并且TG组下颌第1磨牙有龋坏发生（图1）。

图1 2种小鼠CT扫描

2．3 总胶原染色结果 WT组下颌骨相对骨量为（68．56±19．65）%；TG组下颌骨相对骨量为（38．14±14．29）%，TG组的下颌骨相对骨量低于 WT组，差异有统计学意义（t＝4．85，P＜0．05），见图2。

图2 2种小鼠总胶原染色结果（×200）

2．4 HE染色结果 通过对HE染色结果进行统计分析，结果发现，WT组成骨细胞密度（26．24±7．56）／mm，而 TG组为（14．68±6．89）／mm，WT组成骨细胞密度高于 TG组，差异有统计学意义（t＝4．38，P＜0．05），见图3。

图3 2种小鼠HE染色结果（×400）

2．5 免疫组织化学染色结果 通过对TG组和WT组的DSP和聚糖免疫组织化学阳性百分比进行统计分析，结果发现WT

组的聚糖阳性百分比为（6．52±1．28）%，TG 组为（12．68±2．54）%，TG组高于 WT组，差异有统计学意义（t＝8．39，P＜0．05），见图4。

图4 2种小鼠聚糖免疫组织化学染色结果（×400）

2．6 ALP和Ⅰ型胶原mRNA表达水平检测 通过使用RTPCR检测TG组和WT组OCN和Ⅰ型胶原mRNA表达水平，结果发现WT组的OCN和Ⅰ型胶原mRNA表达水平均明显高于TG组，差异有统计学意义（P＜0．05），见表2。

表2 两组小鼠OCN和Ⅰ型胶原mRNA表达

3 讨 论

本研究发现TG组小鼠的血清钙、磷和1，25（OH）2D3的浓度均低于WT组小鼠，并且差异有统计学意义（P＜0．05）。其原因在于体内过高浓度突变的FGF－23抑制1羟化酶的活性，导致1，25（OH）2D3的合成减少，同时减少肾脏、小肠对钙和磷的重吸收，从而导致了血清钙、磷浓度降低［5］。

CT扫描结果表明，TG组小鼠的下颌骨X线透光率明显高于WT组小鼠，表明TG小鼠下颌骨存在矿化障碍，这个研究结果与对1－羟化酶敲除小鼠研究结果基本一致［6］。同时，总胶原染色结果显示TG组小鼠的下颌骨骨量明显低于WT组，差异有统计学意义（P＜0．05）。同时，HE染色结果也发现TG组的单位长度上的成骨细胞数目也明显少于WT组，差异有统计学意义（P＜0．05）。上述研究结果表明，FGF－23（R176Q）过表达导致了成骨细胞减少，进而影响了下颌骨的骨基质的形成和矿化。此外，二聚糖的免疫组织化学结果也提示FGF－23（R176Q）过表达导致了二聚糖在下颌骨中的表达增加。聚糖仅在未矿化的组织中如前期牙本质、未矿化类骨质表达［7］，矿化完成后二聚糖即被分解，而高浓度的二聚糖能够抑制矿化过程的持续进行［8］。本研究同样表明，当 FGF－23（R176Q）过表达时，二聚糖在下颌骨骨基质的蛋白沉积水平增加，表明其下颌骨骨基质中未矿化的基质比例明显增加，由此导致了下颌骨矿化障碍。

此外，FGF－23（R176Q）转基因小鼠下颌骨的OCN和Ⅰ型胶原mRNA表达水平均明显低于 WT小鼠，表明FGF－23（R176Q）过表达抑制了下颌骨成骨细胞的OCN和Ⅰ型胶原mRNA表达。研究表明，OCN能够促进羟基磷灰石晶体的形成和沉积［9］，能促进牙齿和骨骼的矿化［10－11］，而Ⅰ型胶原是骨骼的主要胞外基质，在骨质的形成中起到无机质矿化的框架作用［12］。作者研究发现，FGF－23（R176Q）在体内过表达一方面导致抑制了下颌骨成骨细胞Ⅰ型胶原的合成，导致了下颌骨的胞外基质分泌减少，另外一方面导致了下颌骨成骨细胞OCN合成减少，导致了下颌骨矿化出现异常。

本研究发现，FGF－23（R176Q）转基因小鼠下颌骨出现了骨质疏松、矿化不良等表型，与作者以前研究的1－羟化酶基因敲除小鼠的下颌骨的表型［13－15］较为相似，其主要原因在于FGF－23（R176Q）过表达抑制了1，25（OH）2D3的合成，同时还导致了低钙、低磷血症，并且还导致下颌成骨细胞密度下降，减少了OCN和Ⅰ型胶原mRNA表达水平，阻碍了下颌骨胞外基质的合成与分泌和矿化过程的进行，最终阻碍了下颌骨的正常发育和矿化。

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