经冠状动脉移植同种异体脐带间充质干细胞治疗猪心肌梗死的实验研究

刘房春，张 健，陈卫强，王永德，王一凡，齐向前，刘晓程

（天津医科大学心血管病临床学院泰达国际心血管病医院心内科 300457）

近年来，随着介入技术的不断发展，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者的救治效果获得显著提高，但是，介入治疗方法无法逆转坏死的心肌，对终末期心力衰竭的疗效差。而干细胞具有活跃的增殖能力及多向分化潜能，可能替代、修复或改善受损的心肌组织的生物学功能，成为心肌梗死治疗的“捷径”，显示出了良好的应用前景[1-2]。脐带间充质干细胞作为一种多潜能干细胞，已经进行很多基础和临床研究[3-4]。本实验选用同种异体脐带间充质干细胞作为种子细胞，用导管法经冠状动脉移植，观察其治疗猪心肌梗死的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要仪器、试剂 非啮齿类动物巴马猪16只，雌雄不拘，体质量25～35kg，巴马猪由泰达国际心血管病医院实验室提供[动物合格证号：SCXK（沪）2010-0028]。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定[5]。主要试剂和仪器：博奥森公司兔抗vWF抗体（bs-4754R），SABC免疫组织化学染色试剂盒（SA1022）及DAB显色试剂盒（AR1022），数字减影血管造影机（Philips），7500超声心动图仪（Philips sonos），Datex-ohmeda 7000呼吸机（美国），6FJL4.0造影导管及指引导管，导丝，OTW球囊导管（RyujinPlus）。

1.2 同种异体脐带间充质干细胞的培养、分离及标记 由天津昂赛细胞基因工程有限公司提供。

1.3 心肌梗死模型的制备 术前8h禁食水，称体质量，按0.1mL／kg陆眠宁Ⅱ号联合0.6mg／kg地西泮腹腔注射诱导麻醉，予以丙泊酚（Ⅳ）维持麻醉，气管插管，呼吸机正压辅助呼吸，潮气量120～224mL·kg-1·min-1，持续心电图及血氧饱和度监护。无菌条件下穿刺右股动脉，置入动脉鞘管，注入肝素3 000U，送入2.0×20mm的球囊至前降支中段第一或第二对角支远端，预适应3～5次（如出现室性心律失常，可适当延长预适应时间），每次5～10min后，如无异常，则以2～4个大气压打开球囊堵闭前降支，造影示球囊远端血流中断，持续90min后，缓慢释放球囊。堵塞后心电图示有心肌缺血或梗死改变（T波倒置、ST段抬高、R波波幅降低等）。再次造影观察血供，血供良好撤除导管，压迫止血，送返动物房，术后正常喂养，青霉素240万U／d，连用3d预防感染。

表1 冠状动脉组和对照组各项指标移植前、后比较（±s）

表1 冠状动脉组和对照组各项指标移植前、后比较（±s）

＊：P＜0.05，与同组移植前比较；△：P＜0.05，与对照组移植后6周比较；▽：P＞0.05，与同组移植前比较。

项目移植组移植前 移植后6周对照组移植前 移植后6周LV（mm）43.50±2.67 37.00±2.39＊△ 42.14±2.04 44.43±6.88▽EDV（mm）65.63±8.42 56.86±7.63＊△ 67.14±6.01 70.57±8.50▽ESV（mm）24.63±15.34 16.25±6.45＊△ 22.71±5.65 25.57±7.55▽EF（%）60.50±13.36 71.25±8.94＊△ 65.86±8.93 59.71±7.18▽FS（%）32.88±6.96 39.50±6.85＊△ 36.57±4.61 31.29±5.19▽左室心肌梗死面积 22.34±5.83 15.13±3.23＊△ 20.29±4.72 21.43±5.88▽左室梗死质量比 21.13±4.16 13.13±3.23＊△ 18.57±2.89 22.85±6.49▽

1.4 脐带间充质干细胞移植 心肌梗死模型制备2周后，将造模成功的16只巴马猪分为两组，冠状动脉移植组8只：操作过程同建模过程，经0.014英寸指引导丝将2.3F（Cordis，USA）微导管送至前降支远端，经微导管将含肝素的脐带间充质干细胞悬液（1.0×107个／头，规格20mL：1.0×107个细胞）缓慢推注至冠状动脉内，注射时间为10min，肝素生理盐水冲洗灌注导管2次，复查冠状动脉造影；对照组8只：注射等量的生理盐水。

1.5 超声心动图检查 分别于术前、干细胞移植前和干细胞移植后6周，由1名有经验的超声医师使用Philips Sonos 7500超声心动仪（S3探头频率为1.6～3.2mHz）测量超声心动指标，测量左室舒张末容积（LVEDV）、左室收缩末容积（LVESV）、计算射血分数（EF）、短轴缩短率（FS），取3次测量的平均值作为结果。

1.6 心肌核素显像检查 分别于术前、干细胞移植前和干细胞移植后6周，麻醉后送入核素室，用14.8MBq／kg 99mTc-MIBI行心电门控心肌灌注核素显像。通过Emory Cardiac Toolbox软件量化灌注质量缺损百分比（mass defect percent，MDP）及梗死面积。

1.7 新生毛细血管测定 心脏石蜡切片vWF相关抗原免疫组织化学染色后，光学显微镜下可见血管内皮细胞呈黄褐色（图1），以此可观察毛细血管密度。每个标本取3张切片，在低倍镜（×100）下观察切片全部视野，找到心肌梗死区后转到高倍镜下（×200），每张切片随机取5个200倍视野，取平均数作为测定值。

1.8 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计分析，实验数据以±s表示，组内不同时段数据分析采用配对t检验，组间比较采用两两比较的t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组干细胞移植前和移植后6周超声心动图指标的测定 对照组治疗后6周和治疗前比较各项指标均无改善（P＞0.05）。移植组治疗后6周左室收缩期末内径、舒张末期内径、左室射血分数及短轴缩短率均较治疗前有明显改善（P＜0.05），且与对照组比较亦有明显改善（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组心肌核素显像指标的测定 对照组治疗后6周和治疗前比较各项指标均无改善（P＞0.05）。移植组治疗后6周左室心肌梗死面积、梗死质量比均较治疗前有明显改善（P＜0.05），且与对照组比较亦有明显改善（P＜0.05）。见表1。

2.3 两组新生血管数目的比较 两组猪心肌组织内抗vWF抗体免疫组织化学染色均有阳性（图1），对照组的新生血管数目为（10.24±1.71）个，移植组为（14.71±2.99）个，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 梗死交界区毛细血管vWF多克隆抗体染色（×200）

3 讨论

AMI后常发生左心室重构，最终导致顽固性心力衰竭。虽然溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗及冠状动脉旁路移植术等治疗方法可以挽救濒死心肌细胞，但对坏死的心肌细胞无能为力。Makino等[6]第1次在体外将骨髓间充质干细胞诱导分化成心室肌细胞，从而利用干细胞的多向分化潜能为心肌梗死、心力衰竭的治疗带来新的希望[7]。骨髓干细胞在特定的环境下可分化为心肌细胞，改善心功能，大量的基础和临床研究证实了其能改善心肌梗死患者的预后[8-11]。但是，骨髓干细胞取材具有有创性、分离机取材受时间限制、细胞分化能力低、细胞数量不足等缺点，限制了其应用。脐带间充质干细胞是一种来源广泛、再生能力强、有较强分化潜能、免疫原性低、不诱发畸胎瘤、无病毒感染风险及伦理问题的干细胞[12]。近年来已进行了很多基础和临床研究，引起关注。

经冠状动脉途径移植干细胞是将干细胞经导管注入梗死相关动脉的远端，干细胞在环境的作用下局部经微毛细血管迁移至缺血的心肌中[13]。AMI作为节段性心肌病，通过经导管冠状动脉内注射可以使移植细胞快速到达梗死及其周围组织，使大量的移植细胞在梗死局部聚集。而且由于AMI后炎症细胞的浸润以及炎性介质的释放，梗死区及周围毛细血管扩张通透性升高，有利于干细胞通过毛细血管壁进入梗死心肌中，所以，此种干细胞移植方法创伤小、效率较高。本实验经冠状动脉移植绿色荧光蛋白标记的脐带间充质干细胞至梗死心肌，6周后检查可见绿色荧光蛋白标记的干细胞，表明干细胞在心肌中存活，从而证明经冠状动脉移植是一种有效的移植方法。

本研究显示，干细胞移植组的左室收缩末期内径、舒张末期内径、左室射血分数、短轴缩短率较对照组显著改善，干细胞移植组的左室心肌梗死面积、左室梗死质量比与对照组比较显著缩小，表明经冠状动脉移植脐带间充质干细胞能够改善心肌梗死后心肌的收缩功能、缩小心肌梗死面积。其可能机制：（1）干细胞移植至宿主内存活并分化为心肌细胞，具有心肌细胞能承担的收缩功能。（2）直接分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，形成新的血管；以旁分泌或自分泌的方式分泌促血管生长的细胞因子，促进血管的生长[14]，改善梗死区血供，促进了心功能的恢复。本研究结果显示，干细胞移植组的新生毛细血管的数量多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）干细胞可与宿主细胞建立电-机械耦联，参与心肌的收缩。（4）干细胞移植后减轻心肌的纤维化，维持受损心肌的相对完整性，增加瘢痕组织的弹性，限制心室的扩张，抑制心室的重构，保护了泵功能。（5）移植后新生的心肌细胞增加心脏的顺应性和弹性，改善舒张功能。

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