PKCδ在游离脂肪酸诱导内皮细胞凋亡过程中的作用研究

杨飞燕，陈曼华，蔡 威

（华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院：1.心内科；2.普外科，武汉430014）

蛋白激酶Cδ（protein kinase Cδ，PKCδ）是新型蛋白激酶C（new protein kinase C，nPKC）家族成员，广泛存在于组织细胞中。与传统型PKC（classic protein kinase C，cPKC）和非经典型PKC（atypical protein kinase C，aPKC）不同，PKCδ能被二酰甘油（diacylglycerol，DAG）非Ca2＋依赖性激活。激活后的PKCδ是凋亡信号的重要介导者。2型糖尿病与动脉粥样硬化和血管病变有关，内皮细胞损伤是关键[1]。内皮功能障碍涉及诸多改变，包括细胞增殖、屏障作用、与其他循环细胞的黏附作用以及对凋亡信号的敏感性等[2]。游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）的上升不仅促进靶器官的损伤，也与糖尿病的进展有关[3]。FFAs及高糖均可导致内皮细胞功能紊乱，可能部分是通过PKCα及PKCδ途径来实现的。研究表明[4-7]，FFAs可诱导内皮的功能障碍和血管内皮细胞的损伤。这些数据表明，FFAs在糖尿病复杂的进展中扮演重要角色。然而，FFAs诱导内皮细胞凋亡的机制目前还不甚了解。

细胞增殖和凋亡等多种细胞功能的介质均为活性PKCδ[8-9]。PKCδ的活性是诱导多种细胞凋亡，包括嗜中性粒细胞、角质形成细胞、神经元细胞、成纤维细胞、转化细胞和心肌细胞[10]。由于细胞类型和条件的改变，PKCδ的具体活性是复杂的，在某些情况下促进细胞增殖而在另外一些情况下可能促进细胞凋亡。虽然PKCδ与糖尿病细胞损伤相关，但在血管内皮细胞中FFAs诱导凋亡的具体机制还没有阐明。本研究旨在探讨PKCδ在FFAs诱导内皮细胞凋亡过程中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HUVEC-CS（武汉大学生物保存中心）；FFAs及棕榈酸（Sigma公司）；高糖DMEM培养基及10%胎牛血清（Gibco公司）；PKCδ（Abcam公司）；抗-PKCδsiRNA：PKCδsiRNA kit（Pierce，IL）；实时定量和逆转录试剂盒（Toyobo公司）；转基因3000软件（Corbett Research，Qiagen GmbH，Hilden）；PKCδ-siRNA（Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA）；细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司）；β-肌动蛋白（Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA）。

1.2 细胞培养 来源于武汉大学生物保存中心的人类脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECCS），采用含高糖的DMEM培养基，包含10%胎牛血清，温度37℃，CO2含量5%。

1.3 FFAs和siRNAs处理细胞 根据文献报道的描述制备FFAs[11]。分别在96孔和12孔板上接种HUVEC-CSs，500 μL／孔。当细胞汇合达到60%～70%，培养于DMEM高糖培养基（含2%FBS），培养12h后，转染抗-PKCδsiRNA细胞，然后再次悬浮于无血清的OPTIME，接种到6孔和12孔板，培养48h。提取RNA，用于反转录和实时定量PCR（实时定量和逆转录试剂盒，Toyobo，Japan），其结果的分析使用转基因3000软件。细胞培养按上述进行，细胞同步采用高糖介质进行（含2%FBS），12h。然后细胞用2μg的PKCδ-siRNA转染或者不转染（阴性对照），6h后，最终的浓度为50、75、100 μmol／L，加入FFAs，孵育48h。收取细胞，进行流式细胞仪检测以及细胞凋亡检测。重复3次。

1.4 细胞生存和凋亡分析 采用比色法对经过处理的细胞进行细胞活力检测[12]。将HUVEC-CSs 100μL按照1×104cells／孔的标准接种在96孔板上，孵育6h。每孔加入2μL WST-1试剂，37℃孵育2h，在490nm分光光度计检测。将上述实验重复3次。在不同条件下将细胞与WST-1（10μL／孔）共孵育在96孔板，测定吸光度。分别用0.25%胰酶消化处理各组细胞，调整浓度至5×105／mL，孵育在含5μL膜联蛋白、5 μL PI、2.5μL TritonX-100和RNAse的溶液中，10～15min，避光，进而检测细胞凋亡。然后通过流式细胞仪分析上述细胞。重复上述实验3次。

1.5 蛋白免疫印迹（western blot） 经过上述处理因素处理细胞后，裂解细胞，从细胞裂解液中提取蛋白，在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离。分离的蛋白质从凝胶上转移到PDVF膜。免疫印记使用抗体：PKCδ、p-PKCδTyr512和β-肌动蛋白。将蛋白条的黑色带视作化学表达增强的标志，所有条带均与β-肌动蛋白对比。重复上述实验3次。

1.6 统计学处理 采用SPSS11.0统计分析软件进行数据统计分析。计量资料用±s表示，组内比较采用方差分析，组间数据比较采用最显著差异（LSD）分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PKCδ逆转FFAs抑制HUVEC-CSs增殖 在转染anti-PKCδsiRNA 48h后，HUVEC-CSs中的PKCδmRNA表达显著下调到60%左右。转染阴性对照siRNA不影响PKCδmRNA的表达（图1A）。将细胞暴露于不同浓度的FFAs或转染PKCδsiRNA后，检测细胞的增殖情况（图1B），FFAs处理能够以浓度依赖性的方式抑制HUVEC-CSs的增殖，FFAs浓度越高，增殖率越低（图1B）；PKCδ可逆转FFAs抑制HUVECCSs的增殖。表明PKCδ信号通路可能介导了FFAs诱导HUVEC-CSs的生长抑制效应。

2.2 PKCδsiRNA减少HUVEC-CSs中磷酸化PKCδ表达 细胞氧化应激应答与PKCδ第512位酪氨酸的磷酸化水平有关[13]。为了进一步研究细胞对FFA的应答是否也有这一机制的参与，在不同PKCδ浓度条件下的Try512磷酸化水平下，使用50、75、100μmol／L的FFAs处理，PKCδ-Try512发生了磷酸化，并且PKCδ-Tyr512磷酸化水平增加与FFAs呈浓度依赖性。然而，使用PKCδsiRNA处理HUVEC-CSs后可以明显减少PKCδ及磷酸化PKCδ-Try512的表达（图1C）。

图1 FFAs介导的人脐静脉内皮细胞凋亡过程中PKC的检测

2.3 PKCδsiRNA减少HUVEC-CSs凋亡 对HUVEC-CSs凋亡采用流式细胞术检测分析。使用100μmol／L的FFAs处理48h后细胞的凋亡率是未处理组细胞的14.1倍（图2）。使用PKCδsiRNA处理细胞后，早期凋亡比例减少了79%。

图2 FFAs介导的细胞凋亡过程中流式细胞术检测细胞凋亡

3 讨论

FFAs是中性脂肪分解成的物质。当肌肉活动所需能源肝醣耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为FFAs来充当能源使用。所以，FFAs可说是进行持久活动所需的物质。本实验结果显示FFAs对HUVEC-CSs有多种效应，如浓度依赖性抑制细胞增殖、诱导凋亡、增加PKCδ及磷酸化PKCδ的表达。采用PKCδsiRNA技术抑制PKCδmRNA的表达可以降低细胞凋亡。

PKCδ在内皮细胞增殖中的作用最近由Bai等[14]描述，他们发现PKCδ缺陷大鼠存在损伤动脉内皮化延迟现象。大量研究已证实PKCδ活性与糖尿病相关的病理性血管新生、视网膜外膜细胞凋亡等密切相关[15]。大量研究证实PKC家族参与了代谢及心血管疾病，但不同分子之间存在很大的差异。PKCδ在前凋亡信号通路中起着至关重要的作用。本研究结果进一步证实了PKCδ在高糖中内皮功能失调中的潜在作用。

早期研究报道PKC调控Fas蛋白表达，抑制Fas介导的T细胞凋亡，通过新技术区分PKC不同亚型进行后续研究尚无相关报道。本研究中，FFAs处理HUVEC-CSs A细胞可以显著增加PKCδ及Fas的表达，同时也增加了与PKCδ激酶活性激活相关的磷酸化PKCδ-Tyr512的表达[10]。PKCδsiRNA处理细胞后可以抑制FFAs诱导的Fas及PKCδ的表达，同时也抑制了磷酸化PKCδ-Tyr512的表达。这表明Fas是FFAs诱导的凋亡信号通路中PKCδ的下游信号分子。

本研究也存在着局限性。如进一步研究需要明确PKC表达水平与PKC磷酸化之间的联系。总之，本研究表明PKCδ介导内皮细胞增殖、凋亡，其可能与下游Fas等其他信号相关。

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