血清miR-141和miR-143联合检测非小细胞性肺癌的诊断价值＊

王雨涵，王 洁，张洪为，雷丽明，黄远帅

（泸州医学院附属医院输血科，四川泸州646000）

肺癌是全世界发病率和病死率最高的癌症之一。2012年美国癌症调查结果有226 160例新增病例及160 340例死亡病例。肺癌分为小细胞性肺癌和非小细胞性肺癌，其中，后者占肺癌比例大于80%，且其发病率呈逐年上升趋势[1]。随着诊疗技术的发展，非小细胞性肺癌患者的治疗效果已有所改善，但预后仍不容乐观，总的5年生存率仅15%[2]。因为缺乏早期有效的诊断方法，所以，大部分非小细胞性肺癌患者在确诊时已经失去最佳的治疗时机。目前，非小细胞性肺癌的诊断方式主要有病理活检、影像学检查及实验室检查。病理活检是非小细胞性肺癌诊断的“金标准”，但因为取材和创伤性等原因限制了其在临床的应用。影像学检查如CT一度成为肺癌检测的重要手段，但其假阳性率高达96.4%，检测费用偏高，因此，不适合常规体检[3]。实验室检测项目有CEA、CYFRA21-1、NSE等，但是无论是单项检测或是联合应用，其灵敏度和特异度都不够理想[4-5]。因此，寻找一种新的、诊断效能高的非小细胞性肺癌诊断标志物显得尤为重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。miRNA参与了广泛的生物学过程，如细胞的分化、增殖、凋亡、黏附及死亡等，与癌症的形成及演变密切相关[6]。血清miRNA在作为诊断方面的作用是近年来研究的热点。血清miRNA表达稳定、检测方便、损伤性小，是理想的癌症诊断标志物。血清miRNA在非小细胞性肺癌中的应用已有相关文献报道[7-9]。本研究旨在寻找在非小细胞性肺癌患者血清中特异表达的miRNA，评价其作为非小细胞性肺癌生物标志物的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 样本收集 采集来本院就诊的早期非小细胞性肺癌患者（治疗前，以Ⅰ～Ⅱ期为主）和门诊体检者的血液标本各4mL于BD Vacutainer管内，分离血清，储存于-80℃待用。患者资料见表1，所有癌症患者均经病理检查证实且签署了知情同意书，本研究符合人体试验伦理学标准，并得到本院伦理委员会批准。

1.2 定量RT-PCR（quantitative RT-PCR，qRT-PCR）检测方法 逆转录反应和实时定量PCR技术联合检测训练组共90例标本中miRNA，由于miRNA16大量而稳定地存在于血清中，所以，用它作为内标物质进行标准化[10]。所用试剂为Taqman human miRNA assay kit（由Biosystems，Carlsbad，CA提供），按试剂盒说明书步骤操作。

表1 非小细胞性肺癌和健康对照组的临床基本资料

1.3 数据分析 运用melting curve测定miRNA的Ct值，目的miRNA在癌症组和对照组中的Ct值变化量用2-ΔΔCt来表示。ΔΔCt＝癌症组（Ct目的miRNA-CtmiRNA-16）-对照组（Ct目的miRNACtmiRNA-16）。在训练组中，非小细胞性肺癌和健康人组的miRNACt值比较用Mann-Whitney U检验，组间数据比较使用Fisher检验，筛选出表达差异的miRNA，再用受试者工作曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）比较不同miRNA区分非小细胞性肺癌和健康人组的能力，找到差异最显著的miRNA，计算其灵敏度、特异度、阳性预测值[＝真阳性／（真阳性＋假阳性）×100%]、阴性预测值[＝真阴性／（真阴性＋假阴性）×100%]。然后将筛选出的差异miRNA带入验证组验证其诊断效能（灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值）。使用Graph Pad-Prism V4.03和SPSS17.0统计软件进行统计分析，用Log10的常规转化数来表示相应miRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 血清miR-141和miR-143是非小细胞性肺癌的潜在生物标志物 用qRT-PCR检测训练组中按照年龄、性别和吸烟史匹配的患者标本和健康对照者样本各30例，总共检测到53个表达差异的miRNA。其中，8个能区分非小细胞性肺癌和健康对照者，其灵敏度和特异度均达70%以上，这8个候选的miRNA中有6个独立表达的miRNA。用Fisher检验进行组间对比，最后筛选出4个miRNA，分别为miR-141、miR-143、miR-15b和miR-142-3p，在验证组验证其两两联合诊断非小细胞性肺癌的灵敏度和特异度在73%以上（P＜0.01），见表2、图1，与单独的miRNA比较（图2），联合诊断更有优势，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 验证组中不同miRNA组合对非小细胞性肺癌的诊断效能（%）

图1 非小细胞肺癌miRNA生物标志物的检测过程

图2 miR-141、miR-143、miR-15b和miR-142-3p分别诊断非小细胞肺癌的受试者工作曲线

图3 miR-141和miR-143联合诊断非小细胞肺癌的受试者工作曲线

2.2 血清miR-141和miR-143诊断非小细胞性肺癌的诊断价值 通过计算发现miR-141和miR-143在非小细胞性肺癌组中的表达差异最大，在健康对照组中其分布宽度广（＞4Cts），而在非小细胞性肺癌组分布狭窄（＜2Cts）。用Ct值计算其差异表达值，水平线用来表示数据最佳灵敏度、特异度的阈值。左右两边的表格分别为训练组和验证组中miR-141和miR-143诊断非小细胞性肺癌的诊断价值。绘制出受试者ROC，计算曲线下面积为0.96（图3），在验证组中，经验证其诊断灵敏度和特异度分别为99%和85%，阳性预测值为87%，阴性预测值为99%。

3 讨论

本研究发现miR-141和miR-143联合诊断能将非小细胞性肺癌患者从健康对照者中区分开，且具有较高的诊断价值：灵敏度和特异度分别为99%和85%，阳性预测值为87%，阴性预测值为99%，说明二者可以成为非小细胞性肺癌的诊断生物标志物，这与之前的一些研究吻合[11-12]，但本研究标本量更大，资料及分组更加详尽。已有一些关于miR-141和miR-143在非小细胞性肺癌中的文献研究表明，它们与非小细胞性肺癌的发生、发展有着重要的联系，并且成为诊断标志物。Tejero等[13]指出，miR-141和miR-200c作为早期诊断非小细胞肺癌的标志物在疾病分型中有不同的表达（腺癌中高表达）并影响其预后。Zeng等[14]研究表明，miR-143是非小细胞肺癌早期诊断的标志物，miR-150是区分鳞癌和腺癌的早期标志物。miR-141和miR-143作为非小细胞肺癌的标志物已有一些文献支撑，但二者联合诊断非小细胞肺癌的研究尚未发现，基于目前的研究现状，本研究发现二者联合诊断非小细胞肺癌有较高的诊断价值。虽然本研究的数据显示了较好的诊断效能，但若要应用于临床，仍需要扩大样本量，找到每个分类或者分型的标志物将对疾病诊断更加特异。

有关miR-141和miR-143的研究显示，其表达差异不仅局限于肺癌。有报道指出，其在肝细胞癌、宫颈鳞癌等疾病中也起着一定的作用，说明它们的表达并不具有特异性，所以单个miRNA作为疾病诊断的标志物有着一定的风险。已知联合检测比单项检测具有更高的检测价值，而在后期的研究中不仅可以考虑多个相关的miRNA联合检测，更可以尝试将miRNA与传统的肺癌检测标志物（如CYFRA21-1、NSE等）联合检测，在横向上拓宽了研究的思路。另外，有关非小细胞性肺癌的miRNA研究中，也发现其他miRNA表现出一定的诊断价值。有研究指出，miR-126也可区分非小细胞性肺癌和健康人，其灵敏度为73%，特异度为96%[15]。也有学者指出miR-126和miR-98也能较好地区分非小细胞性肺癌和健康对照者，miR-126在肺组织中高表达与血管细胞黏附分子Ⅰ（VCAM-Ⅰ）的调控有关。这为后期研究提供了很好的思路，即研究标志物的作用机制，这样，标志物不仅可以作为疾病诊断和预后判断的标准，同时也可以阐明疾病发生、发展的机制，在纵向上加深了研究的深度。

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