牙周源性牙周牙髓联合病变患牙微生物感染与影响因素分析

叶　菲，戴方毅，刘　敏

(1.武汉市汉口医院口腔科，武汉 430012； 2.武汉市3604医院口腔科,武汉 430033)

牙周源性牙周牙髓联合病变患牙微生物感染与影响因素分析

叶菲1※，戴方毅1，刘敏2

(1.武汉市汉口医院口腔科，武汉 430012； 2.武汉市3604医院口腔科,武汉 430033)

摘要：目的探讨牙周源性牙周牙髓联合病变患牙微生物感染的菌种及影响因素。方法选择2012年1月至2013年12月来武汉市汉口医院就诊的牙周源性牙周牙髓联合病变患者和正常正畸拔除者各32例(32颗)为研究对象，采集样本的牙周袋、根管标本，检测标本中微生物的感染情况及其牙周源性牙周牙髓联合病变发病的影响因素。结果32例牙周源性牙周牙髓联合病变样本中微生物感染的检出率为46.9%，以奈瑟菌属、棒状杆菌属、放线菌属、弯曲菌属、梭杆菌属以及嗜血杆菌属为主。32例正常对照样本中微生物感染的检出率为18.8%，主要为奈瑟菌属、放线菌属和弯曲菌属。奈瑟菌属、棒状杆菌属、放线菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属感染为牙周源性牙周牙髓联合病变发生的主要影响因素。结论微生物感染的种类与牙周源性牙周牙髓联合病变的发生密切相关，临床应采取不同的治疗方案以提高联合病变的治愈率、降低患者失牙率。

关键词：牙周牙髓联合病变；牙周源性；牙根管；感染现状

牙周源性牙周牙髓联合病变指牙周来源、牙髓炎症与牙周破坏的综合病变，是失牙的主要原因之一[1]，其发生的主要原因是细菌感染。随着分子生物学技术的不断发展，聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳结合法等检测微生物菌群方法的应用促进了口腔生物学的发展，其明确了牙周牙髓联合病变的菌群及作用机制，减少了患者的痛苦。本研究采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳结合法观察牙周源性牙周牙髓联合病变患处牙根管的微生物情况，分析其来源及与发病的关系，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选择2012年1月至2013年12月来武汉市汉口医院就诊的牙周源性牙周牙髓联合病变患者32例，其中男20例、女12例，年龄32~67岁，平均(38.3±5.5)岁。患者患牙均行影像学检查，选取因慢性牙周炎致Ⅱ°~Ⅲ°松动并拔除的1颗患牙为标本，所取患牙牙周袋深度≥5 mm[2]，可探诊深度至根尖，且患牙均无龋、无隐裂等牙体疾病，患者3个月内未使用过抗生素。选取32例同期来院因正畸而拔除牙齿的患者作为对照组，男39例，女13例，年龄33~68岁，平均(39.8±2.8)岁，对照组样本均无牙体疾病及其他口腔疾病。两组研究对象在性别、年龄等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医学伦理委员会批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1样本采集方法牙周袋取样时，将牙周袋隔湿吹干，以吸潮纸纸尖先行蘸取牙周袋牙冠2/3的龈沟液，之后迅速放入牙周袋底部，20~30 s后取出，以无菌剪刀剪下纸尖尖端5 mm作为牙周袋标本，同时以无菌刮治器探入牙周袋底部，刮取牙根菌斑；根管采样时，在患牙拔出后，在根尖1/3处截断，如无成形牙髓，采用蘸有无菌生理盐水的无菌锉反复锉根尖1/3处的根管后壁，之后将无菌吸潮纸插入，停留20~30 s取出，以无菌剪刀剪下其尖端5 mm作为根管标本。

1.2.2样本检测方法样本离心，去上清后取细菌基因组，DNA提取试剂盒提取DNA[天根生化科技(北京)有限公司]，之后进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，采用细菌通用引物[3]。模板DNA加热至93 ℃ 4 min后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离形成单链，以便与引物结合；模板DNA经加热变性行成单链后，温度降至55 ℃，引物与模板DNA单链按互补原则配对结合；DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸过程(根据不同的PCR引物序列，设置不同的退火温度和时长。第一步扩增：93 ℃变性4 min，56 ℃退火40 s，70 ℃延伸1.5 min；第二步：93 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；72 ℃优化7 min[4])。PCR反应体系为50 μL，以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。采用电泳仪，每个样本取35 μL，变性剂的梯度为40%~60%，进行100%变性；之后采用1∶10 000 的SYBR GreenⅠ核酸燃料染色40 min；然后采用凝胶成像拍照，并将有代表性的条带进行切胶、克隆测序，并使用GenBank的BLAST对测序结果进行序列分析和序列同源性比较[4-5]。

2结果

2.1微生物检出情况32例牙周源性牙周牙髓联合病变中，15例存在微生物感染，检出率为46.9%。根管和牙周袋的菌种为厚壁菌门的奈瑟菌属。根管样本检测菌属为放线菌门的棒状杆菌属和放线菌属；牙周袋菌属为变形菌门的弯曲菌属、梭杆菌门的梭杆菌属和变形菌门的嗜血杆菌属。32例对照样本中，6例存在微生物感染，检出率为18.8%，为奈瑟菌属、放线菌属和弯曲菌属(图1~6)。

2.2牙周袋与根管条带分析牙周袋样本菌种条带值为(10.24±1.98)；根管菌种条带值为(5.73±1.54)，比较差异有统计学意义(t=9.172，P<0.05)，两者菌种有不同。对牙周袋和根管菌种条带进行相似分析，其相似系数为11.4%~68.6%；不同样本牙周袋细菌条带相似系数为28.2%~75.9%，根管相似系数为12.2%~48.3%。

2.3微生物感染与发病危险因素以奈瑟菌属、棒状杆菌属、放线菌属、弯曲菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属、牙周袋感染、根管感染为因变量，以牙周源性牙周牙髓联合病变(阳性=1，阴性=0)为应变量Y进行多因素Logistic回归分析，牙周源性牙周牙髓联合病变发病的危险因素为奈瑟菌属、棒状杆菌属、放线菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属的感染(P<0.05)，见表1。

表1　微生物感染的种类和部位与牙周源性

3讨论

牙髓组织与牙周组织的解剖学结构互通，两者的感染和病变常相互影响和扩散，因而常导致联合病变的发生[6]。研究发现，细菌感染是牙周病和牙髓病的主要致病因素[7]。国内外对可能引起牙周源性牙周牙髓联合病变的细菌种类研究较少，因此本研究检测牙周牙髓联合病变患牙中牙周袋和根管内微生物情况，并对患牙微生物感染与牙周源性牙周牙髓联合病变发生的关联性进行了研究，以为临床预防和治疗该病提供依据。

本研究结果显示，32例牙周源性牙周牙髓联合病变样本中微生物感染的检出率为46.9%，而32例正常对照样本中微生物感染的检出率为18.8%。根管和牙周袋的形似菌种均为奈瑟菌属；根管中检出的菌属为棒状杆菌属和放线菌属；牙周袋菌属为弯曲菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属；而正常对照样本中为奈瑟菌属、放线菌属和弯曲菌属，说明病原微生物可能为棒状杆菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属。对牙周袋与根管菌种的条带进行相似分析显示，其相似系数为11.42%~68.63%，说明两者的菌种条带分布属于不同的操作单位，两者共有的条带数较少，也说明牙周袋与根管的细菌的属类存在差异；根管的相似系数为12.22%~48.28%，推测根管的菌种部分来源于牙周组织。

微生物检测结果显示，牙周源性牙周牙髓联合病变时根管内细菌的种类少于牙周袋，但导致牙周源性牙周牙髓联合病变的微生物种类与牙周袋微生物种类部分来源相同，这与文献报道的结果相似[8-10]。本研究Logistic回归分析显示，牙周源性牙周牙髓联合病变的危险因素是奈瑟菌属、棒状杆菌属、放线菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属的感染，而另有文献报道，牙周疾病多与牙卟啉单胞菌相关[11-12]，两者不同的原因可能与选取的对象以及检测方法不同有关，可通过增加观察样本量和采取相同的检测方法加以解决。有研究证实，不同病原微生物所导致的组织破坏机制和临床表现不同，因此牙周袋和根管种微生物种类不同，其所导致的牙周牙髓联合病变程度也可能不同[13]。

总之，口腔内微生物可成为牙周源性牙周牙髓联合病变的潜在致病菌。临床可根据不同的致病微生物采取不同的治疗方案，以提高牙周源性牙周牙髓联合病变的治愈率、降低患者失牙率。

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Study on Microbial Infection Periodontal-originated Combined Periodontal-endodontic Lesions and Ralated Risk Factors

YEFei1,DAIFang-yi1,LIUMin2.(1.DepartmentofStomatology,HankouHospitalofWuhanCity,Wuhan430012,China; 2.DepartmentofStomatology,No.3604HospitalofWuhanCity,Wuhan430033,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the correlation between microbial strains and infection situation of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions and related risk factors.MethodsA total of 32 cases of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions and another 32 cases of normal orthodontic pulling teeth treated in Hankou Hospital from Jan.2012 to Dec.2013 were selected as research objects.Samples of periodontal pocket and root tube were collected for microbial testing,and correlation between microbial contamination and the development of disease was analyzed.ResultsThe detection rate of microbial infection in 32 cases of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions was 46.9%,the main microorganisms infected were Neisseria, Corynebacterium,Actinomyces,Campylobacter,Fusobacterium and Haemophilus.The detection rate of microbial infection in 32 cases of normal teeth was 18.8%,the main microorganisms included Neisseria,Actinomyces and Campylobacter.Neisseria,Corynebacterium,Actinomyces,Fusobacterium and Haemophilus were the main factors that influence on the incidence of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions.ConclusionThe species of microorganisms infected are closely related to the incidence of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions.Proper therapy should be adopted in clinic in order to improve the cure rate and reduce the rate of lost tooth.

Key words:Periodontal-endodontic combined lesions; Periodontal-origianted; Root canal; Infection situation

收稿日期：2014-03-20修回日期：2014-08-08编辑：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.068

中图分类号：R781.4

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)10-1901-03