高危型人乳头瘤病毒阳性的宫颈癌组织中L1基因甲基化水平变化及意义

付玉娇，胡元晶(天津医科大学研究生院，天津 300070；天津市中心妇产科医院)



高危型人乳头瘤病毒阳性的宫颈癌组织中L1基因甲基化水平变化及意义

付玉娇1，胡元晶2(1天津医科大学研究生院，天津 300070；2天津市中心妇产科医院)

摘要：目的观察持续性高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)阳性的宫颈癌组织中长散布核元件-1(L1)基因甲基化水平变化，并探讨其意义。方法收集HR-HPV均阳性的正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变(CIN) I组织、CINⅡ～Ⅲ组织及宫颈癌组织各30份。采用亚硫酸氢盐转化结合焦磷酸测序技术对所有组织DNA的 L1序列3 个CpG 位点进行甲基化定量检测，评价其对子宫颈癌和CIN的诊断价值。结果正常宫颈组织、CIN Ⅰ组织、CINⅡ～Ⅲ组织及宫颈癌组织中L1基因平均甲基化水平分别为0.590±0.053、0.570±0.038、0.560±0.025、0.490±0.054，宫颈癌组织中L1基因平均甲基化水平与其他组织中比较，P均<0.001。选取L1基因启动子区甲基化水平的截断值为53.17%，此时其判断宫颈病变性质的灵敏度及特异度均为86.70%。95%置信区间(CI)为0.834～0.976。结论 HR-HPV阳性的宫颈癌组织中L1基因甲基化水平明显降低。L1基因启动子区甲基化水平为53.17%时，有助于宫颈病变性质的判断。

关键词：子宫肿瘤；宫颈癌；长散布核元件-1；DNA甲基化

宫颈癌近年来在中国的发病率及病死率呈明显上升趋势[1]。持续性高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是导致宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的主要原因[2]。宫颈脱落细胞学联合HR-HPV的检测是目前宫颈癌筛查的重要手段，但仍存在漏诊[3]。因此，需要有新的标志物来作为宫颈病变筛查、诊断等的有效手段。基因甲基化在众多肿瘤的发生中具有重要意义，是表观遗传学的一种常见过程。有研究[4]发现,基因甲基化在宫颈癌的发生发展过程起重要作用。长散布核元-1(L1)拷贝数>50万，约占全基因组的17%，L1基因甲基化水平与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关[5]。本研究对HR-HPV阳性宫颈病变组织中L1基因启动子区的甲基化水平进行了检测，并探讨其意义。

1资料与方法

1.1临床资料收集2014年5～10 月在天津市中心妇产科医院妇科门诊就诊首次阴道镜活检发现宫颈异常,同时经第2 代杂交捕获(HC-Ⅱ)证实HR-HPV阳性患者。共纳入120 例研究对象，年龄22～65(43.05±10.59)岁。其中正常宫颈(正常组)、CINⅠ(CINⅠ组)、CINⅡ～Ⅲ(CINⅡ～Ⅲ组)、宫颈鳞癌(宫颈癌组)组织各30份。所有组织经病理组织学检查证实。每份约50 mg 组织，放入液氮中保存以备提取基因组DNA。

1.2主要试剂及仪器基因组DNA 亚硫酸盐处理试剂盒(Zymo Research)； DreamTaqTM Green Master Mix(Fermentas)； 焦磷酸测序试剂(QIAGEN)； Universal 32R低温离心机(Hettieh)；紫外可见光分光光度计NanoDrop 2000(Thermo)；PCR扩增仪(ABI)； PyroMarkQ96 ID 焦磷酸测序仪(QIAGEN)；所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1DNA提取及化学修饰采用酚—氯仿抽提法提取宫颈组织DNA。提取后使用紫外可见光分光光度计测定DNA A260/A280值在1.7 ～2.0为合格样品，并计算DNA含量，-80 ℃保存备用。DNA 亚硫酸盐修饰:取500 ng DNA，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit TM说明书对基因组DNA进行甲基化修饰，-20 ℃保存备用。

1.3.2DNA体外扩增对组织DNA的L1基因启动子甲基化区域进行PCR扩增。50 μL的PCR扩增体系中包括Mix 25 μL，无核酶水22 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA(30 ng/μL)1 μL。PCR循环参数：95 ℃、5 min,95 ℃、30 s,50 ℃、30 s,72 ℃、30 s，50次循环;72 ℃、5 min。将PCR产物行2 %琼脂糖凝胶电泳,在146 bp位置得到单一条带，即可进行焦磷酸测序。以双蒸水代替模板作为空白对照。L1基因的特异性PCR引物及焦磷酸测序引物序列均参考文献[6]。L1基因上游引物5′-TTTTGAGTTAGGTGTGGGATATA-3′,下游引物:生物素标记的5′-AAAATCAAAAAATTCCCTTTC-3′；焦磷酸测序引物：5′-AGTTAGGTGTGGGATATAGT-3′。

1.3.3L1基因启动子区甲基化检测采用焦磷酸测序法。取35 μL PCR扩增产物至PSQ 96 Plate Low 样品制备板中，加入30 μL 结合缓冲液和4 μL 包被有链亲和素的磁珠，42 ℃震荡孵育15 min。将探针置入96 孔板上的PCR产物中捕获带有双链DNA 产物的磁珠，依次经70%乙醇、变性溶液及洗涤液处理5～10 s后制备成单链DNA，并将其释放入已准备好的测序反应体系中。反应体系40 μL，包括退火缓冲液38.8 μL，10 μmol/L测序引物1.2 μL。80 ℃温育2 min，降至室温后上机进行焦磷酸测序，通过Pyro Q-CpG 1.0.9软件获得L1基因启动子区3个位点的甲基化水平定量分析数据[7]。

1.3.4判断宫颈病变性质的L1基因启动子区甲基化截断值的确定根据L1 在不同病变组织中的甲基化水平，描绘ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)，选取合适的截断值用于区分宫颈病变性质。

2结果

2.1L1基因启动子区甲基化检测结果扩增的片段位于L1基因启动子区211～356 bp(Genebank Accesion number: X58075)处,可检测到3个CpG 位点。宫颈癌组在检测的3个CpG位点及3个CpG位点平均甲基化水平(CpG-M)均明显低于其他组(P<0.001)，正常组、CINⅠ组、CINⅡ～Ⅲ组间的甲基化水平比较差异无统计学意义，详见表1。

±s)

注：与宫颈癌组相比，﹡P<0.001。

2.2判断宫颈病变性质的L1基因启动子区甲基化截断值根据ROC曲线，计算的AUC为0.905，为减少临床漏诊率，选取L1的截断值为53.17%，此时其灵敏度及特异度均为86.70%。95%可信区间(CI)为0.834～0.976。

3讨论

DNA甲基化在调控基因表达及染色体结构方面发挥着重要作用。近年来，国内外研究发现多种基因在宫颈癌的发生发展中发生甲基化修饰，且这种表观遗传学改变与宫颈病变程度有一定相关性。研究者用基因特异位点甲基化研究方法研究宫颈脱落细胞、血浆标本和宫颈活检组织等，提出DNA甲基化可用于宫颈癌筛查[8,9]。我们既往研究[10]发现，HPV16基因长控制区和抑癌基因E2结合区域L1片段3′端甲基化水平与其致病性有关。

人类染色体中心体周围的异染色质紧密封装着大量DNA重复序列，其中L1是人类基因组中最丰富的能自主转座的非末端重复序列反转录转座子。为减少转录“噪音”，提高转录效率，在正常细胞中，异染色质处于高度甲基化的表观遗传学上的沉默状态。但在肿瘤中，基因组的低甲基化往往伴随着DNA重复序列的低甲基化。L1序列的低甲基化现象已在多种肿瘤中被证实，包括头颈部恶性肿瘤[11]、膀胱上皮癌[12]、胃癌[13]、结直肠癌[14]等。目前，L1甲基化状态已成为肿瘤基因组整体甲基化水平的标记物[15]。

本研究结果显示，宫颈癌组在检测的3个CpG位点及其CpG-M甲基化程度均明显低于其他组，表明L1基因低甲基化水平与宫颈癌发生密切相关,宫颈癌和其他肿瘤一样,也存在整体基因组甲基化水平降低的现象,这为宫颈癌发生发展中的机制研究提供了新的表观遗传学思路。研究[16]报道，CpG位点甲基化水平的降低易导致染色体结构的不稳定，是L1 激活后转录与反转座的主要原因,这种激活与肿瘤发生密切相关。

焦磷酸测序技术能快速检测甲基化的频率, 对样品中的甲基化位点进行定位及定量检测。通过焦磷酸测序技术定量检测L1在不同宫颈组织中的甲基化程度，绘制ROC曲线，得出AUC 为0.905，表明该方法诊断价值较高。参考ROC曲线，并考虑尽可能减少漏诊率，选定截断值为53.17%，判断良恶性宫颈病变的灵敏度及特异度均为86.70%，这一结果表明，L1基因甲基化水平对预测和早期诊断宫颈癌具有重要意义。

综上所述，L1基因低甲基化水平与宫颈癌发生密切相关。在后续工作中我们将进一步检测宫颈病变中抑癌基因甲基化水平，研究其与宫颈癌发生、发展及预后的关系。

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The methylation level changes of the L1 gene in high-risk human papillomavirus

positive cervical cancer tissue and its significance

FUYu-jiao1， HU Yuan-jing

(1TianjinMedicalUniversityGraduateSchool,Tianjin300070，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of methylation level of the long interspersed nucleotid element-1(L1)in persistent high-risk human papillomavirus (HR-HPV) positive cervical cancer tissue and its significance．MethodsThirty tissue samples were collected in all HR-HPV infected normal cervix, cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ, CINⅡ-CINⅢ and cervical cancer respectively. Three CpG sites methylation levels of the L1 of all tissues were quantitatively analyzed by bisulphite conversion and pyrosequencing technology． Evaluated its diagnostic value in cervical cancer and CIN. ResultsThe mean levels and standard deviation of the L1 promoter methylation level of normal cervix tissue, CINⅠtissue, CINⅡ～Ⅲ tissue and cervical cancer tissue were 0.59±0.053, 0.57±0.038, 0.56±0.025, 0.49±0.054 respectively. Compared the L1 promoter mean methylation level of cervical cancer tissues with other tissues, allP<0.001. Selected the cutoff value of the L1 gene methylation level as 53.17%, both the sensitivity and specificity to judge the property of cervical lesions were 86.70%, with the 95% confidence interval (CI) was 0.834～0.976. ConclusionsThe L1 gene methylation level of HR-HPV positive cervical cancer tissue decrease significantly. It helps to judge the property of cervical lesions with the L1 gene promoter methylation level of 53.17%.

Key words:cervical lesions; cervical cancer; long interspersed nucleotid element-1; DNA methylation

(收稿日期：2014-11-07)

通信作者简介：胡元晶(1971-)，女，博士，主任医师，研究方向为妇科肿瘤。E-mail:tdjhyj@hotmail.com

作者简介：第一付玉娇(1987-)，女，在读研究生，研究方向为妇科肿瘤。E-mail:fuyujiao2012@163.com

基金项目：天津市卫生局科技基金资助项目(13KG134)。

中图分类号：R737.33

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)03-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.003