直肠黏液腺癌组织中四种耐药基因蛋白的表达变化及意义

杨成万，陶明珠，龙汉安(泸州医学院附属医院，四川泸州 646000)



直肠黏液腺癌组织中四种耐药基因蛋白的表达变化及意义

杨成万，陶明珠，龙汉安(泸州医学院附属医院，四川泸州 646000)

摘要：目的观察直肠黏液腺癌(MUC)组织中多药耐药基因p-糖蛋白(p-gp)、胸苷酸合酶(TS)、谷胱甘肽转移酶-π(GST-π)、DNA拓扑异构酶(TopoⅡ)的表达变化，并探讨其意义。方法应用免疫组化SP法对37例直肠黏液腺癌及261例直肠非黏液腺癌(non-MUC)组织中p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白进行检测，并分析其与MUC临床病理参数的关系。结果直肠黏液腺癌与非黏液腺癌组织中p-gp阳性表达率分别为81.1%、94.5%，TS阳性表达率分别为83.8%、72.0%，GST-π阳性表达率分别为51.4%、73.9%，TopoⅡ阳性表达率分别为62.2%、71.6%，直肠黏液腺癌与非黏液腺癌组织中p-gp、GST-π阳性表达率比较，P均<0.01。GST-π与直肠黏液腺癌分化程度有关，高中分化者GST-π阳性表达率明显高于低分化者(P<0.01)，p-gp、TS、TopoⅡ表达与直肠黏液腺癌临床病理参数间无相关性。p-gp与TS表达呈正相关(r=0.349，P<0.05)。结论直肠黏液腺癌组织中TS表达升高，p-gp、GST-π、TopoⅡ表达降低，GST-π表达与直肠黏液腺癌分化程度有关；四种耐药基因蛋白联合检测可为直肠黏液腺癌化疗药物的筛选及个体化治疗方案制定提供依据。

关键词：直肠肿瘤；黏液腺癌；p-糖蛋白；谷胱甘肽转移酶；DNA拓扑异构酶；胸苷酸合酶；多药耐药

大肠黏液腺癌是大肠癌的一种特殊类型，占大肠癌患者的1.6%～25.4%[1，2]，主要治疗手段是手术切除结合化疗的综合治疗模式。直肠黏液腺癌可切除率低，易对化疗药物耐药，治疗效果不佳。明确相关耐药基因产物在直肠黏液腺癌组织中的表达特点对了解直肠黏液腺癌的生物学特性、指导患者个性化治疗有重要意义[3]。本研究观察了直肠黏液腺癌组织中耐药基因蛋白p-糖蛋白(p-gp)、谷胱甘肽转移酶-π(GST-π)、DNA拓扑异构酶(Topo Ⅱ)、胸苷酸合酶(TS)表达变化，并探讨其意义。现将结果报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料2010年1月～2013年10月就诊于泸州医学院附属医院的直肠癌患者298例，男179例、女119例，平均年龄62.35岁。术前均未行放疗、化疗等治疗。依据WHO黏液腺癌的判定标准[4]进行分类，黏液腺癌(黏液样物质占肿瘤体积的50.0%以上)37例，非黏液腺癌261例。298例均经手术治疗并留取肿瘤组织。

1.2p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ检测方法所有标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，进行连续切片，采用免疫组化SP法进行染色。按试剂盒说明书进行操作，以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照，以各自已知阳性切片作为阳性对照。p-gp阳性表达于细胞膜和细胞质，TS和 GST-π阳性表达于细胞质，TopoⅡ阳性表达于细胞核。相应部位出现棕黄色颗粒即判为阳性表达。p-gp、TS和GST-π阳性强度以+表示，随机计数10个高倍视野，统计阳性细胞数，阳性细胞数<10%为(-)，10%～25%为(+)，26%～75%为(++)，≥75%为(+++)。TopoⅡ阳性标准以级别表示，阳性细胞数<25%为Ⅰ级，26%～50%为Ⅱ级，51%～75%为Ⅲ级，>75%为Ⅳ级。(-)和(+)或Ⅰ级视为阴性，≥(++)或Ⅱ级视为阳性，p-gp、TS、GST-π≥(++)、TopoⅡ≤Ⅰ级具有诊断意义，表明肿瘤具有多药耐药性[5，6]。

1.3统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，采用Pearson相关分析法对p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白表达进行相关性分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2结果

直肠黏液腺癌与非黏液腺癌组织中p-gp阳性表达率分别为81.1%、94.5%，TS阳性表达率分别为83.8%、72%，GST-π阳性表达率分别为51.4%、73.9%，Topo Ⅱ阳性表达率分别为62.2%、71.6%，直肠黏液腺癌与非黏液腺癌组织中p-gp、GST-π阳性表达率比较，P均<0.01。GST-π与直肠黏液腺癌分化程度有关，高中分化者GST-π阳性表达率明显高于低分化者(P<0.01)；p-gp、TS、Topo Ⅱ在直肠黏液腺癌组织中的表达与临床病理参数间无明显相关性(P>0.05),见表1。p-gp与TS呈正相关(r=0.349，P<0.05)，而其余指标间无明显相关性。

表1　p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白表达与直肠黏液腺癌临床病理参数的关系(例)

3讨论

黏液腺癌是直肠癌的特殊类型，可切除率低，选择敏感的化疗药物对术后化疗有重要意义。肿瘤多药耐药是导致肿瘤化疗失败的重要原因。目前已发现，p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ在多种肿瘤耐药性上发挥重要作用，但对直肠黏液腺癌同时检测上述4种蛋白表达及其意义的研究尚未见报道。

p-gp是由7号染色体上的多药耐药基因1(MDR1)编码的跨膜糖蛋白，为一种ATP依赖性跨膜转运泵，其跨膜结构具有能量依赖性“药物泵”功能，能将细胞内带阳性电荷的亲脂类化疗药物逆浓度泵至细胞外，使细胞内化疗药物达不到有效作用浓度从而产生耐药性[7]。因而p-gp的表达水平与耐药程度呈正比。其所介导的抗癌药物主要为植物碱类、阿霉素、紫杉醇和泰素帝等。本研究直肠黏液腺癌组织中p-gp阳性表达率率为81.1%,明显低于非黏液腺癌，说明直肠黏液腺癌对植物碱类、阿霉素等药物化疗较非黏液腺癌相对敏感。直肠黏液腺癌p-gp表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、临床分期等无相关性，说明直肠黏液腺癌在p-gp介导的多药耐药机制上不同于其他大肠癌。

GST是一组具有解毒和结合蛋白质功能的同工酶，与多药耐药相关的有GST-α、GST-μ和GST-π。其中GST-π是肿瘤细胞和组织中最常见且与肿瘤耐药关系最密切的一种亚型，其能催化亲电子物质与GST结合，并与亲脂性细胞毒药物结合增加其水溶性，促进药物代谢，从而降低抗癌药物的细胞毒作用。其过度表达与顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁和阿霉素耐药有关。本研究直肠黏液腺癌组织中GST-π阳性表达率明显低于直肠非黏液腺癌，说明直肠黏液腺癌对顺铂、氮芥等化疗药物较非黏液腺癌相对敏感，GST-π阳性表达与黏液腺癌分化程度呈正相关。

TS是胸苷酸合成的限速酶，其功能是催化尿嘧啶脱氧核苷(dUMP)甲基化为胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)，此步骤为DNA生物合成所必须，故TS被抑制，将抑制DNA合成进而抑制细胞的生长和增殖。研究表明TS与肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性呈明显负相关，当TS过度表达时，不能彻底阻断TS，将导致肿瘤细胞对5-FU耐药，低表达的TS预示着肿瘤细胞对5-FU较好的敏感性[8，9]。本研究显示，直肠黏液腺癌TS阳性表达率与非黏液腺癌无显著性差异，均对5-FU有较高的耐药性，进行TS检测将有助于确定是否选用5-FU化疗。TS表达与p-gp呈明显正相关，提示二者在直肠黏液腺癌的多药耐药发生机制中可能发挥某种协同作用。

TopoⅡ是DNA复制必需的酶，催化单链或是双链DNA断裂，促进DNA复制。当基因发生突变时，抗癌药物不能与其结合，产生细胞耐药。以TopoⅡ为靶点的药物主要为蒽环类抗生素和鬼臼霉素类如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素和阿霉素等。本研究结果显示，直肠黏液腺癌TopoⅡ阳性率与非黏液腺癌无明显差异，且与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期等无明显关系。与王恒树等[10]对大肠癌的研究结果不同，后者发现大肠癌TopoⅡ表达与分化程度、临床分期呈正相关，与淋巴结转移呈负相关。说明直肠黏液腺癌在TopoⅡ介导的多药耐药机制上不同于其他大肠癌。

本研究结果显示，p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ在直肠黏液腺癌组织中均有表达，且直肠黏液腺癌组织中p-gp、GST-π阳性表达率明显低于非黏液腺癌，而GST-π与直肠黏液腺癌分化程度有关，高中分化者GST-π阳性表达率明显高于低分化者。本组直肠黏液腺癌p-gp与TS共表达率高达73.0%，而相关分析结果显示p-gp与TS呈正相关，提示二者可能存在相互调节机制。可见直肠黏液腺癌多药耐药机制是多基因、多途径共同参与的结果，联合检测p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ可为直肠黏液腺癌化疗药物的筛选及个体化治疗方案制定提供重要依据。

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Significance of expression of 4 drug resistant gene proteins p-gp, TS, GST-π

and TopoⅡin mucousadenocarcinoma of the rectum

YANGCheng-wan，TAOMing-zhu，LONGHan-an

(TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the change of expression of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡ in mucousadenocarcinoma(MUC) of the rectum, and investigate its significance. Methods The expression of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡ in 37 cases of MUC and 261 cases of non- mucousadenocarcinoma (non-MUC) of the rectum was detected by using immunohistochemical SP method．ResultsThe positive expression rate of p-gp in MUC and non-MUC was 81.1% and 94.5%，respectively. The positive rate of TS was 83.8% and 72.0%, the positive rate of GST-π was 51.4% and 73.9%, and the positive rate of TopoⅡwas 62.2% and 71.6%. The positive expression rate of p-gp and GST-π in MUC was significantly lower than that in non-MUC (P<0.01). The expression of GST-π was correlated with tumor degree of differentiation, and the positive rate of GST-π in well or moderately differentiated MUC was significantly higher than that in poorly differentiated MUC (P<0.01). The expression of p-gp, TS and TopoⅡ was not correlated with clinical and pathological features of MUC. P-gp expression was positively correlated to TS expression (P<0.05). ConclusionThe expression of TS is heightened and the expression of p-gp, GST-π and TopoⅡ is degraded in MUC of the rectum. The expression of GST-π is correlated with tumor degree of differentiation．The joint detection of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡwill be useful for choosing sensitive chemotherapeutic drugs and selecting individual therapeutic regimen in rectum MUC treatment.

Key words:rectum； mucousadenocarcinoma； p- glycoprotein； Thymidylate synthase； glutathione transferase-π；topoisomeraseⅡ； multidrug resistance

(收稿日期：2014-10-11)

通信作者简介：龙汉安(1964-)，男，硕士，教授，主要研究方向为肿瘤病理。Email：longhanan@qq.com

作者简介：第一杨成万(1969-)，男，硕士，副教授，主要研究方向为肿瘤病理。E-mail:ycwty@163.com

基金项目：四川省应用基础研究计划项目(14JC0039)。

中图分类号：R735.37

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)03-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.002