家族性帕金森病相关遗传基因LRRK2 的差异性研究

姜立刚，李海平，王朝辉，孙博谦，李 威

家族性帕金森病是一种常染色体显性遗传疾病，约占帕金森病总量的5%～10%，主要的临床特征为静止性震颤、动作迟缓、肌肉僵直等［1］。据报道，该疾病的病发与多种基因遗传特性存在相关性，LRRK2 基因(Leucine-rich Repeat Kinase 2)是其中一种能够引起家族性帕金森病的关键基因［2］，在该基因上已经发现了多种突变位点［3，4］，其中p.G2019S突变型是欧洲人群较为常见的基因型，大约有5%～13%的帕金森患者携带该基因，而在亚洲人群则比较少见［5，6］;p.R1441G/C/H 基因型也是欧洲人群常见的基因型，其中p.R1441G 基因型主要发现于西班牙人群，在其他地区人群中极少出现，尚不清楚该基因型在亚洲人群的分布情况［7，8］;p.K616R基因型在汉族人群中首先被发现，尚未在其他种族人群中被检出［9］，这些结果显示，家族性帕金森病的LRRK2 基因的突变类型及频率均有很大的区域性和种族差异性，因此，虽然目前对家族性帕金森病相关遗传基因的差异性已经有了一定的研究，但是由于针对汉族人群的遗传差异性研究还不多见，因此，对汉族人群家族性帕金森病的LRRK2基因的突变类型及频率进行研究仍具有很大的意义。本文对来源于汉族人群的21 例家族性帕金森症患者，其中包括1 个帕金森病家族的3 例家族性帕金森病患者的LRRK2 基因7 种突变类型进行Sanger 检测，并分析其携带的基因突变型与其他种族人群的差异性。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料 全血基因组DNA 提取试剂盒购自德国Qiagen 公司;Taq DNA 聚合酶及dNTP 购自大连TAKARA 公司;琼脂糖凝胶购自美国Sigma公司;LRRK2 基因目标扩增序列来源于NCBI 网站，引物设计参考文献［10］，引物由上海英俊公司订购;PCR 扩增仪器购自杭州朗基科技股份有限公司;凝胶成像仪器购自上海天能科技股份有限公司。

1.2 研究对象 于2013 年11 月～2015 年3月期间收集吉林省通化地区、吉林省白山地区汉族家族性帕金森病患者21 例，其中男性患者13 例，女性患者8 例，且已知有3 例家族性帕金森病为一个家族的两代人。男性患者年龄为57.4±12.1 岁，患病年龄为52.4±11.3 岁，患病时间为6.13±5.42 y;女性患者年龄为59.7±13.2 岁，患病年龄为51.7±11.6 岁，患病时间为6.34±5.31 y。患者临床症状包含静止性震颤、动作迟缓及肌肉强直3 项指标中的2 项相则诊断为帕金森病，其中有些患者接受过多巴胺治疗。所有病例研究均经患者本人同意，并经伦理委员会批准。

1.3 基因型检测 分别抽取患者5 ml 外周血，采用全血提取试剂盒(Qiagen，德国)提取全血基因组DNA。采用文献引物扩增LRRK2 基因上的p.K616R、p.R1441G、p.R1441C、p.Y1699C、p.G2019S、p.I2020T 及p.G2385R 7 种突变位点［10］。50 μl 反应扩增体系包括1×buffer、1 μmol/L 上游引物、1 μmol/L 下游引物、0.5 mM dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶，加入50 ng 基因组DNA 作为模板，扩增程序为:95 ℃2 min，95 ℃1 min，55 ℃20 s，72 ℃1 min，72 ℃10 min。扩增产物经电泳验证后，由上海华大基因进行Sanger 测序。

1.4123I-IMP SPECT 显像 采用碘代苯异丙胺单质子X 线断层摄影术(123I-IMP SPECT)对来自一个家族的3 例帕金森病进行区域脑血流量检测。

1.5 数据分析 采用Chromas 2.4 查看Sanger测序图谱，统计每例样本的基因分型，并分析每种基因突变型在汉族人群中分布频率。

2 结果

2.1 基因突变型分布频率分析 对Sanger 测序结果进行分析后，得到如表1 所示的LRRK2 基因上的7 种基因型频率分布如表1 所示，21 例家族性帕金森病患者中，p.G2385R 突变型最多，达到23.8%;而p.R1441G 突变型有3 例，占总病例数的14.3%;p.K616R 突变型有2 例，占总病例数的4.76%;而其他突变型如p.G2019S、p.R1441C、p.Y1699C及p.I2020T 则未检出，均为0%。结果显示，p.G2019S 基因突变型在汉族人群中所占的比例较大，且根据突变型频率分布，帕金森症的基因型分布具有很显著的家族性，如p.R1441G 突变型仅在一个家族中被检出。

表1 7 种基因型频率分布

2.2 家系图谱分析 在对病例中3 个来自于一个家族的帕金森病患者进行后期的追踪中发现，该家族除了收录的3 例帕金森病例外在第一代中还有3 例已经患了该病的病例，但未在本研究内。该家族的帕金森病谱系及来源于该家族的3 例家族性帕金森病病例的Sanger 测序结果分别如图1A 及图1B 所示。如图1A，该家族中1a、1c、1e、1h、2b、2d 共6 个成员患帕金森病，根据Sanger 测序结果(见图1B)显示，帕金森病患者1h、2b、2d 均存在p.R1441G(LRRK2 4321C＞G)，其健康的兄弟2c 作为正常对照组。

2.3 病例分析 采用碘代苯异丙胺的123I-IMP SPECT 成像技术对来自一个家族的3 例家族性帕金森病患者进行检测，结果如图2 所示，图3A、图3B及图3C 分别对应2d、1h 及2b。结果显示，患者2 d的123I-IMP SPECT 结果正常;患者1h 的123I-IMP SPECT 结果则显示患者双侧额叶区血流量明显下降;患者2b 的123I-IMP SPECT 结果则显示患者右侧基底节区血流量明显下降。

图1 一家族性帕金森病谱系及基因突变型分析

图2 123I-IMP SPECT 成像分析

3 讨论

LRRK2 基因位于12 号染色体上，包含有51 个外显子，LRRK2 蛋白共包含2527 氨基酸残基的多功能域蛋白分子，因此，LRRK2 蛋白在多种细胞信号通路中具有重要的作用［11］。在多种功能域中，位于ROC 羧基端上的GTPase 功能域较为重要，在生理条件下能够水解GTP，而当LRRK2 基因发生突变后，表达的LRRK2 蛋白GTPase 将被抑制，因而影响机体细胞的正常生理功能，目前已经证实，该蛋白与帕金森病存在很重要的关系［12］。在LRRK2 蛋白的重要性逐渐被揭示的同时，LRRK2 基因的单核苷酸多样性也逐渐被揭示，继p.R1441G 和p.Y1699C 在欧洲地区的英格兰人和巴斯克人两种族人群中被检出后，其他不同突变体也逐渐在世界不同地区和种族人群被检出［13，14］，目前已经证实该基因是帕金森病常染色体显性遗传基因中突变频率最高且最常见的致病基因。

本文以21 例家族性帕金森病患者为对象，对能够引起家族性帕金森病的LRRK2 基因上的7 种已知突变类型通过扩增在测序进行分析研究，发现在21 例患者中，p.G2385R 突变型最多，达到23.8%;而p.R1441G 突变型有3 例，占总病例数的14.3%;p.K616R 突变型有2 例，占总病例数的4.76%;而其他突变型如p.G2019S、p.R1441C、p.Y1699C 及p.I2020T 则未检出，均为0%。这一结果与其他地区的研究结果存在一定的差异性。根据以往的研究，家族性帕金森病突变基因LRRK2 基因的突变频率在不同的区域和种族中具有很大的差异。p.G2019S突变型在世界范围内多种族、多地区均很常见的引起家族性帕金森症的基因突变型，但是该突变型在不同的地区也呈现很大的频率差异［15］，在北非人群中分别频率最高，达到35.7%，其中在突尼斯人中高达达到42%，而欧人人群中仅占4%，但是在西班牙人群中则达到18.7%，亚洲人群更低，分布频率小于0.1%，这些结果与本研究结果基本相吻合。在亚洲人群中，p.G2385R 基因型是LRRK2 基因上一种较为常见的引起家族性帕金森病的突变类型，其中在中国汉族人群中该位点基因突变型是目前出现频率最高的一种基因型，在中国台湾人群中帕金森患者中有11.7%存在该基因位点的突变型，本文研究中该突变位点的频率为8.39%，而在亚洲以外的其他地区还未见该位点的突变型被检出。在目前的研究中，p.R1441G 突变类型主要出现在西班牙北部尤其是巴斯克人种群中，在亚洲人群中也偶有出现，但频率较低，而本研究中发现了一个携带p.R1441G突变类型的家族，但在其他病例中未见有该基因位点突变，这说明LRRK2 的该基因突变类型也是一种世界范围的突变位点。另外，p.K616R 基因突变类型是最新在中国人群中发现的一种LRRK2基因突变型［9］，在本研究的21 例家族性帕金森患者中也发现了2 例患者携带该类型的突变基因，这在一定程度上证实了中国人群中确实存在LRRK2 p.K616R这一基因突变类型。

根据先前的研究，携带有p.R1441G 突变类型的巴斯克人帕金森症家族患病成员的病理特征包括对左旋多巴治疗敏感、肌肉僵直、运动障碍等均与先天性帕金森症很相似，另外，携带该基因的家族成员患病由早发的迹象(发病年龄小于50 岁)，而在本研究中也显示家族性帕金森病患者2b 和2d 也存在早发的迹象。在123I-IMP SPECT 成像检测中则显示，携带有p.R1441G 突变帕金森病患者与先天性帕金森症存在差异性，如患者1h 的123I-IMP SPECT 成像显示了脑额叶血流灌注不足，而患者2b 的123I-IMP SPECT 成像则显示脑基底神经节灌注不足，这些现象与与先天性帕金森症存在差异［16］。针对携带有p.R1441G 突变帕金森病患者与先天性帕金森症的更深层次的联系还有待于进一步的研究。

4 小 结

本文通过对21 例家族性帕金森病患者包括3例来源于同一家族的患者的研究，采用Sanger 测序获得每个患者LRRK2 基因上的7 种基因突变类型。在21 例患者样本中，首次在中国人群中发现来自一个家族3 例携带p.R1441G 的帕金森患者，同时携带p.G2385R 突变基因型的患者最多，而北非地区患者携带比例达到35.7%的p.G2019S 突变基因型在中国人群中未发现该突变类型，中国人群中新发现的p.K616R 突变基因型在本研究的患者中占4.76%，而p.R1441C、p.Y1699C 及p.I2020T 则未检出。与以往的研究对比显示，家族性帕金森病携带的LRRK2 基因突变型及突变频率均存在区域和种族的差异性。在对来自同一个家族、携带p.R1441G 突变基因型的3 例帕金森患者的研究中发现，其临床特征与先天性帕金森病存在一定的差异，需要进一步的研究。

［1］Lees AJ，Hardy J，Revesz T.Parkinson’s disease［J］.Lancet，2009，373(9680):2055-2066.

［2］Rideout HJ，Stefanis L.The neurobiology of LRRK2 and its role in the pathogenesis of Parkinson’s disease［J］.Neurochem Res，2014，39(3):576-592.

［3］Hatano T，Funayama M，Kubo S，et al.Identification of a Japanese family with LRRK2 p.R1441G-related Parkinson’s disease［J］.Neurobiol Aging，2014，35(11):17-23.

［4］Esteves AR，Swerdlow RH，Cardoso SM.LRRK2，a puzzling protein:insights into Parkinson’s disease pathogenesis［J］.Exp Neurol，2014，261:206-216.

［5］Gaig C，Vilas D，Infante J，et al.Nonmotor symptoms in LRRK2 G2019S associated Parkinson’s disease［J］.PLoS One，2014，9(10):e108982.

［6］Chien HF，Figueiredo TR，Hollaender MA，et al.Frequency of the LRRK2 G2019S mutation in late-onset sporadic patients with Parkinson’s disease［J］.Arq Neuropsiquiatr，2014，72(5):356-359.

［7］Estanga A，Rodriguez-Oroz MC，Ruiz-Martinez J，et al.Cognitive dysfunction in Parkinson’s disease related to the R1441G mutation in LRRK2［J］.Parkinsonism Relat Disord，2014，20(10):1097-1100.

［8］Bahnassawy L，Nicklas S，Palm T，et al.The parkinson’s disease-associated LRRK2 mutation R1441G inhibits neuronal differentiation of neural stem cells［J］.Stem Cells Dev，2013，22(18):2487-2496.

［9］Wang L，Guo JF，Nie LL，et al.A novel LRRK2 mutation in a mainland Chinese patient with familial Parkinson’s disease［J］.Neurosci Lett，2010，468(3):198-201.

［10］Zimprich A，Biskup S，Leitner P，et al.Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology［J］.Neuron，2004，44(4):601-607.

［11］Funayama M，Hasegawa K，Kowa H，et al.A new locus for Parkinson’s disease(PARK8)maps to chromosome 12p11.2-q13.1［J］.Ann Neurol，2002，51(3):296-301.

［12］Moore DJ.The biology and pathobiology of LRRK2:implications for Parkinson’s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2008，14(Suppl 2):S92-98.

［13］Bardien S，Lesage S，Brice A，et al.Genetic characteristics of leucine-rich repeat kinase 2(LRRK2)associated Parkinson’s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2011，17(7):501-508.

［14］Clark LN，Kisselev S，Park N，et al.Mutations in the Parkinson’s disease genes，Leucine Rich Repeat Kinase 2(LRRK2)and Glucocerebrosidase(GBA)，are not associated with essential tremor［J］.Parkinsonism Relat Disord，2010，16(2):132-135.

［15］Correia Guedes L，Ferreira JJ，Rosa MM，et al.Worldwide frequency of G2019S LRRK2 mutation in Parkinson’s disease:a systematic review［J］.Parkinsonism Relat Disord，2010，16(4):237-242.

［16］Abe Y，Kachi T，Kato T，et al.Occipital hypoperfusion in Parkinson’s disease without dementia:correlation to impaired cortical visual processing［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2003，74(4):419-422.