18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在LN229脑胶质模型体内生物分布和Micro-PET显像

高 霞，张 斌，王 斌 ，黄洪波，李新平

(1.武汉市第五医院，湖北 武汉 430050；2.江苏省原子医学研究所，江苏 无锡 214000；3.无锡米度生物技术有限公司，江苏 无锡 214000)

18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在LN229脑胶质模型体内生物分布和Micro-PET显像

高 霞1，张 斌1，王 斌1，黄洪波2，李新平3

(1.武汉市第五医院，湖北 武汉 430050；2.江苏省原子医学研究所，江苏 无锡 214000；3.无锡米度生物技术有限公司，江苏 无锡 214000)

为研究肿瘤显像剂18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在LN229脑胶质瘤模型裸鼠体内分布和Micro-PET肿瘤显像，采用酪氨酸和NOTA修饰的[c(RGDyK)]2为前体分别合成18F-FET和18F-RGD；颅内注射LN229细胞建立脑胶质瘤模型，研究18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在注射30 min和60 min体内脏器分布以及荷瘤鼠Micro-PET显像。结果表明，18F-FET和18F-RGD放化纯度大于95%。荷瘤鼠体内分布显示，注射后1 h，18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在脑胶质瘤和脑组织内(括号内)的摄取分别为(4.89±0.65)%ID/g((2.72±0.76)%ID/g)、(2.10±0.32)%ID/g((0.23±0.01)%ID/g)、(3.02±0.64)%ID/g((0.74±0.12)%ID/g)，18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在肿瘤和脑摄取放射性比值分别为0.64±0.07(1.80±0.32)、8.22±1.03(9.13±1.21)和2.15±0.48(4.08±0.92)，Micro-PET肿瘤显像清晰。结果提示，18F-FET和18F-RGD更适用于脑胶质瘤的诊断。

脑胶质瘤；Micro-PET显像；O-(2-18F-氟代乙基)-L-酪氨酸

脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，起源于神经间质细胞，因其部位的特殊性及治疗后容易复发，死亡率及致残率均较高。脑胶质瘤的分级不同其临床表现、治疗方法及预后均不相同，因此，在手术前做出明确诊疗十分重要[1]。电子计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)等影像学检查虽然对胶质瘤定位诊断有很好的价值，但定性诊断仍有欠缺。近年来，正电子发射断层显像(PET)被认为是诊断脑胶质瘤的有效手段，核素诊断因其利用了可以被恶性肿瘤特异性摄取的标记化合物显像，具有灵敏度高，特异性强，无创伤等特点越来越受到重视。但是不同的正电子显像剂在脑胶质瘤中分布显像结果有很大的差异，选择合适的显像剂是诊断脑胶质瘤的关键，本研究建立原位脑胶质瘤模型，通过18F-FDG、18F-FET和18F-RGD三种显像剂进行Micro-PET显像和体内分布，比较三种不同显像剂在原位脑胶质瘤裸鼠模型中的体内分布和Micro-PET脑胶质瘤显像效果。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 细胞 人源性脑胶质瘤细胞株(LN229)，购自上海科学院细胞库。

1.1.2 实验动物 Balb/c裸鼠，雄性，体重20～25 g，动物购自上海克莱斯实验动物有限责任公司，实验动物合格证号SCXK(沪)2007-0005。

1.1.3 试剂 氨基聚醚(K2.2.2)：美国Sigma公司；L-酪氨酸：百灵威化学试剂有限公司；异氟烷：美国 Minrad Inc公司；无水乙腈：百灵威化学试剂有限公司；乙二醇二对甲基苯磺酸酯：百灵威化学试剂有限公司。

1.2 仪器

医用回旋加速器：日本住友重机械株式会社公司产品，HM-7型；Micro-PET扫描仪：德国Siemens公司产品，Inveon型；γ计数仪：美国铂金埃尔默仪器有限公司产品，1 470wizard；活度计：德国PTW公司产品，CURIEMENTOR 3型。

2 实验方法

2.1 显像剂合成

18F-FDG由无锡第四人民医院提供；18F-FET显像剂参考文献方法[2]进行合成，富集在QMA离子交换树脂柱上的18F-离子用1 mL Kryptofix/K2CO3溶液洗脱至反应瓶，通氮气条件下115 ℃蒸干，再加2 mL无水乙腈蒸干；加入8 mg乙二醇二对甲苯磺酸酯(溶于0.6 mL无水乙腈)，90 ℃反应10 min。冷却加入4 mL无水乙醚，过硅胶小分离柱，蒸除乙醚；反应管中加8 mg酪氨酸二钠、0.6 mL二甲基亚砜，90 ℃反应10 min。加入1 mL无水乙醚，过硅胶小分离柱，用4 mL无水乙醚洗柱，吹干；再用3 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH为7.4)洗脱，收集洗脱液，过0.22 μm无菌滤膜，得到注射液，反应式见图1。通过高效液相色谱及其放射性检测器检测产品的放化纯度。

图1 18F-FET放射性合成反应Fig.1 Radiosynthesis of 18F-FET

18F-RGD显像剂参考文献方法[3]进行合成，标记前体NOTA-PRGD2(32 μg)和1.6 μg氯化铝经200 μL乙醇溶解后，加入5%醋酸40 μL，混匀后加入30～100 μL新鲜制得的18F-离子，密闭100 ℃下反应10 min，冷却；加15 mL水稀释后注入C18分离小柱，5 mL PBS和8 mL水冲洗柱子后用300 μL乙醇洗脱标记产品，生理盐水稀释后无菌过滤即得18F-RGD注射液，通过高效液相色谱及其放射性检测器检测产品的放化纯度。

图2 18F-RGD放射性合成反应式Fig.2 Radiosynthesis of 18F-RGD

2.2 LN229脑胶质瘤模型

取对数生长期的LN229细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，离心去上清，然后用无血清培养基离心洗涤2次，计数，调整细胞浓度，将细胞悬浮于PBS中备用。裸鼠麻醉后，将其固定在立体定向仪上，剪去头顶部眼裂至外耳道之间的毛发，常规消毒后于中线处眼裂后作一长约1 cm垂直切口，暴露前囟，取其前方1 mm，右侧距中线1 mm处钻孔，其直径约为1 mm，接种肿瘤细胞。从恒温水浴中取出配好的细胞悬液，以10 μL微量注射器吸取5 μL(含LN229细胞约为1×105个)固定于电极移动架上。调整移动架位置，使针尖位于骨孔内，缓慢垂直进针2 mm，缓慢注入细胞悬液，注射完成后缓慢拔针。以骨蜡封闭骨窗，逐层缝合关颅，2周后可观察到裸鼠消瘦，脑壳微微凸起，在组织分布实验中，取出裸鼠大脑，可发现脑部肿瘤和脑组织有明显界限，分离正常脑组织和瘤组织[4]。

2.3 生物分布

LN229脑胶质瘤裸鼠通过尾静脉分别注射3.7 MBq(100 μCi)18F-FDG、18F-RGD和18F-FET ，在注射后30 min和60 min分别处死6只裸鼠，取脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉(骨骼肌)、脾、骨头、肿瘤等感兴趣脏器，所有样品称重后用γ计数仪测定放射性计数，计算每克脏器的放射性计数占注入剂量的百分数即放射性摄取率(%ID/g)。

2.4 Micro-PET扫描显像

脑胶质瘤裸鼠扫描前称重，异氟烷麻醉，尾静脉分别注射18F-FDG、18F-RGD和18F-FET 60 min后，俯位固定在扫描床上，静态扫描10 min，18F-FDG扫描前需禁食12 h。

Micro-PET扫描显像的参数：层厚0.78 mm，矩阵128*128，采集时间10 min，采集能窗350～650 keV。扫描采集结束后，将扫描的图像用OSEM 3D迭代重建，迭代2次，重建后利用医学分析软件PMOD勾画脑部为感兴趣区域(ROI)，利用软件可以实现脑部及脑胶质瘤的勾画，并得到相应感兴趣区域上放射性物质摄取的平均值。

3 实验结果

3.1 显像剂合成

18F-FET总放化产率(未校正)为(26.5±1.5)%(n=4)，放化纯度>95%，质控结果示于图3； 应用手动合成的18F-RGD，总放化产率(未校正)为(39.7±2.9)%(n=4)，放射性和紫外HPLC检测表明，18F-RGD保留时间为14 min，放化纯度>95%；质控结果示于图4。

图3 18F-FET紫外吸收峰及放射性吸收峰Fig.3 The radiochemical purity of 18F-FET by HPLC and the UV absorption

3.2 生物分布

18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在LN229脑胶质瘤裸鼠体内分布结果见表1。18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在血液中放射性由30 min时的(1.92±0.24)%ID/g、(0.45±0.12)%ID/g和(2.42±0.55)%ID/g下降到60 min时的(0.45±0.11)%ID/g、(0.17±0.02)%ID/g和(1.29±0.48)%ID/g，其他各组织脏器从30 min到60 min也都呈下降趋势。

图4 18F-RGD的紫外吸收峰及放射性吸收峰Fig.4 The radiochemical purity of 18F-RGD by HPLC and the UV absorption

表1 尾静脉注射18F-FDG、18F-RGD和18F-FET后在LN229裸鼠体内分布Table 1 Tissue distribution of radioactivity in glioma nude mice after intravenous injection of 18F-FDG, 18F-RGD and 18F-FET

肿瘤与肌肉放射性摄取比从30 min的6.83±1.09、5.51±0.92和4.38±0.92上升到60 min的8.23±1.73、7.72±0.87和4.79±1.12；肿瘤与脑摄取比从30 min的0.64±0.07、8.22±1.03和2.15±0.48上升到60 min的1.80±0.32、9.13±1.21和4.08±0.92。

3.3 Micro-PET扫描结果

LN229脑胶质瘤模型通过三种不同显像剂18F-FDG、18F-RGD和18F-FET进行Micro-PET扫描，扫描结果示于图7。18F-FDG扫描发现，脑胶质瘤部位肿瘤摄取清晰，同时其他正常脑组织部位摄取也比较高；18F-RGD扫描图可见，脑胶质瘤部位摄取明显，脑部摄取很低；18F-FET扫描图中可见，肿瘤摄取明显，正常脑部摄取较低，肿瘤和正常脑组织有明显界限。

a，b，c分别为不同显像剂18F-FDG、18F-RGD和18F-FET扫描图片；1，2，3分别为矢状位、冠状位和横状位，白色箭头所指位置为肿瘤图7 18F-FDG、18F-RGD和18F-FET Micro-PET 扫描图Fig.7 Micro-PET imaging of 18F-FDG,18F-RGD and 18F-FET

4 讨论

18F-FDG体内分布显示，虽然肿瘤/肌肉放射性摄取比达到30 min 6.83±1.09和60 min 8.23±1.73，但肿瘤/脑仅为30 min 0.64±0.07和60 min 1.80±0.32，并且从Micro-PET扫描图像上很难确定肿瘤与正常脑组织的区分界线，主要因为18F-FDG不是特异性的显像剂，在炎症组织中也同样表现为摄取增高，而且由于脑组织能量来源于葡萄糖，所以18F-FDG 在正常脑组织内大量积聚，PET图像本底高，导致病灶与周围正常脑组织对比差异小，不利于脑内肿瘤的显示及诊断。

18F-RGD和18F-FET体内分布肿瘤/脑放射性摄取比分别达到30 min 8.22±1.03、2.15±0.48和60 min 9.13±1.21、4.08±0.92，而且Micro-PET扫描结果显示，脑胶质瘤对18F-RGD、18F-FET都有很高的摄取，显像清晰界限明显[5-6]，有助于18F-RGD、18F-FET对脑胶质瘤的鉴别诊断[7]。主要是因为18F-RGD可以与肿瘤中αvβ3受体特异性结合，18F-FET作为氨基酸PET显像剂，临床研究表明，氨基酸转运在各种肿瘤的恶性转化中增加，18F-FET显影剂在低级别和高级别胶质母细胞瘤中显示活性，且不依赖于破坏血脑屏障。

综上所述，18F-FDG、18F-RGD和18F-FET均可对脑胶质瘤裸鼠模型进行显像，但以具有特异性显像的18F-RGD和18F-FET显像效果更佳，能使肿瘤与脑组织界限更清晰，适于临床脑胶质瘤鉴别诊断和愈后观察。

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Biodistribution and Micro-PET Imaging of18F-FDG、18F-RGD and18F-FET in LN229 Glioma Model

GAO Xia1, ZHANG Bin1, WANG Bin1, HUANG Hong-bo2, LI Xin-ping3

(1.TheFifthHospitalofWuhanCity,Wuhan430050,China; 2.JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Wuxi214000,China; 3.WuxiMolecularImagingCROCO.,LTD.,Wuxi214000,China)

Biodistributions of micro-PET tracer18F-FDG,18F-RGD, and18F-FET in the LN229 induced glioma nude mice were performed using micro-PET technology. Tyrosine and NOTA modified [c(RGDyK)]2were employed as precursors for the synthesis of18F-FET and18F-RGD. Glioma model was established via intracerebral injection of LN229 cells and the biodistribution in tumor and major organs at 30 min and 60 min postinjection of18F-FDG,18F-RGD, and18F-FET were determined by Gamma counting, respectively. The results showed more than 98% purity for18F-FET and18F-RGD. After 60 min injection of three radiotracers, the uptake values of18F-FDG,18F-RGD, and18F-FET in tumor and brain were 4.89±0.65%ID/g ((2.72±0.76)%ID/g), 2.10±0.32%ID/g ((0.23±0.01)%ID/g), and 3.02±0.64%ID/g ((0.74±0.12)%ID/g), respectively. In addition, the ratio of tumor to brain of18F-FDG,18F-RGD, and18F-FET were determined as 0.64±0.07(1.80±0.32)、 8.22±1.03(9.13±1.21) and 2.15±0.48(4.08±0.92). Micro-PET imaging also represented a clearly visualized tumor circumscription. In conclusion, micro-PET combined with18F-FET and18F-RGD could be a promising technique for the diagnosis and research of glioma.

glioma tumor; Micro-PET imaging; O-(2-18F-fluoroethyl)-L-tyrosine

10.7538/tws.2015.28.03.0155

2014-00-00;

2014-00-00

江苏省原子医学研究所开放课题(KF2011066)；江苏省创新基金( BC2012043)

高 霞(1980—)，女，武汉人，主治医师，肿瘤学专业

张 斌，主治医生，E-mail: 13329737428@163.com

TL92+3

A

1000-7512(2015)03-0155-05