无载体放射性碘标记MIBG的制备及初步生物分布

樊彩云，邓新荣，刘子华，李凤林，罗志福

(中国原子能科学研究院，北京 102413)

无载体放射性碘标记MIBG的制备及初步生物分布

樊彩云，邓新荣，刘子华，李凤林，罗志福

(中国原子能科学研究院，北京 102413)

无载体放射性碘标记间碘苄胍(no-carrier-added,n.c.a.123/131I-MIBG)在肿瘤、心肌显像和神经内分泌肿瘤的治疗方面有理论上优势。首先合成了以多氟化合物为支持体的标记前体，对该前体进行了放射性碘标记、纯化和初步生物分布实验。结果显示，无载体放射性碘125I标记MIBG在正常小鼠的心、脾、肺和肾上腺中的摄取显著高于目前商用的放射性碘标记MIBG。利用该方法标记后产物不需要使用HPLC进行纯化，适用于大规模临床应用。

间碘苄胍；无载体；多氟化合物支持体

MIBG是肾上腺素能神经元阻滞剂溴苄胺和胍乙啶的类似物，也是神经递质去甲肾上腺素的功能性类似物[1]。MIBG能与肾上腺素受体结合，且具有高度特异性，可与富含肾上腺素受体的组织和器官结合，如肾上腺髓质、心肌以及相关肿瘤。1994年美国FDA批准[131I]MIBG(Iobenguane Sulfate I 131TM，NDA20-084)用于诊断嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤。2008年美国FDA批准[123I]MIBG(AdreViewTM)用于儿童和成年人神经内分泌肿瘤的诊断。目前临床上使用的[*I]MIBG采用同位素交换法制备，得到的产品carrier-added(c.a.)[*I]MIBG中含有大量稳定的MIBG，比活度低，不利于疾病的诊断和治疗，用药量高时还会产生高血压、恶心、头昏等副作用。由于c.a.[*I]MIBG存在弊端，n.c.a.[*I]MIBG的制备和应用研究逐渐得到重视，研究表明，n.c.a.[*I]MIBG的诊断和治疗效果优于c.a.[*I]MIBG[2-13]。与商业化的c.a.[*I]MIBG相比，n.c.a.[*I]MIBG的制备要复杂得多。自1993年以来，相继出现了多种n.c.a.[*I]MIBG的制备方法[14-22]，但大多数方法均需要在标记后使用HPLC对标记产物进行纯化，不利于大规模制备和临床应用。由于125I较123/131I易得，本工作拟利用多氟化合物支持体制备n.c.a.[125I]MIBG，并进行初步生物分布研究，该方法的优势在于标记前体的合成和标记后产物的纯化相对简单，将为n.c.a.[*I]MIBG大规模临床研究及应用提供基础。

1 实验材料

1.1 主要仪器

模拟标记产物的分析条件：安捷伦1200高效液相色谱系统，美国安捷伦公司产品；HPLC柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱(4.6×150 mm)；紫外检测波长为230 nm；洗脱溶剂：20% CH3CN(0.1% H3PO4)-H2O(0.1% H3PO4)溶液，洗脱速度为1 mL/min；MIBG溶解于20% CH3CN(0.1% H3PO4)-H2O(0.1% H3PO4)溶液中，得到浓度为0.1 mg/mL的标准溶液；n.c.a.[125I]MIBG的分析条件：HPLC，Varian公司；GABI型放射性检测器：Raytest公司；C18色谱柱：Hypersil ODS，4.6×250 mm；洗脱剂A为H2O(0.1%TFA)，洗脱剂B为CH3CN(0.1%TFA)；梯度洗脱程序为：0～30 min，0～100%溶剂B；30～32 min，100%溶剂B；32～35 min，100～0%溶剂B。

实验动物：昆明小白鼠25只，18～20 g，清洁级，北京华阜康生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)锡溴和氟固相萃取柱：Sigma-Aldrich公司；3-溴苄胺盐酸盐、1,2-二(氯二甲基硅)乙烷、叔丁基锂、1H-吡唑甲咪盐酸盐和FC-72(全氟己烷)：Acros公司；MIBG：ABX公司；Na125I溶液：PerkinElmer公司；其他试剂均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

2 实验方法

2.1 标记前体的合成

n.c.a.[*I]MIBG的制备路线如图1所示。

图1 n.c.a.[*I]MIBG的制备路线Fig.1 Preparation of n.c.a.[*I]MIBG

2.1.1 3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)锡苄胺(化合物2)的合成

3-溴苄胺盐酸盐(0.800 g，3.6 mmol)悬浮于15 mL CH2Cl2中，用10%NaHCO3溶液洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥过夜。抽滤，旋蒸除去溶剂，得浅黄色油状物。将此油状物(0.543 g，2.92 mmol)溶于5 mL CH2Cl2，加入Et3N(0.720 g，7.13 mmol)，搅拌30 min。然后将1,2-二(氯二甲基硅)乙烷(0.654 g，2.92 mmol)溶解于CH2Cl2，并将其滴入3-溴苄胺中，在冰水浴下搅拌1.5 h后室温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，加入5 mL正己烷，抽滤除去不溶物，旋蒸除去溶剂后得浅黄色油状物。将该产物(200 mg，0.609 mmol)溶于10 mL THF，在-78 ℃下冷却，向其中加入叔丁基锂(1.6 mol/L，0.7 mL)，滴加完毕后继续搅拌40 min。将3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)锡溴(0.688 g，0.555 mmol)溶于4 mL THF并滴入反应液中，然后在-78 ℃下搅拌2 h，然后恢复至室温。向反应混合物中加入5 mL FC-72，搅拌10 min后加入10 mL CH3OH终止反应。分出FC-72相，再用FC-72萃取(5 mL×4)，合并FC-72相，旋蒸除去溶剂，得无色油状物。向其中加入20 mL V(CH3OH)∶V(H2O)=9∶1溶液，用1 mol/L HCl调pH至4～5，搅拌过夜。向反应物混合物中加入4 mL 2 mol/L NaOH，搅拌5 min后旋转蒸发除去CH3OH，用FC-72萃取(5 mL×4)，合并FC-72相。旋蒸除去溶剂得黄色油状物，用硅胶柱纯化得浅黄色油状物(化合物2)[20]。用核磁共振(1H NMR和13C NMR)和质谱表征结构。

2.1.2 3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)锡苄胍(化合物3)的合成

将化合物2(100 mg)溶于5 mL CH2Cl2，加入1H-吡唑甲咪盐酸盐(23.15 mg，158 μmol)和Et3N(237 μmol)，室温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，向残余物中加入5 mL FC-72，用CH3CN萃取(4 mL×3)，旋蒸除去溶剂得浅黄色粘稠液体(化合物3)。用核磁共振(1H NMR和13C NMR)和质谱表征结构。

2.2 模拟标记

非放射性碘标记(模拟标记)MIBG的制备反应如图2所示。将标记前体3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)锡苄胍溶于甲醇，制成20 g/L的溶液。取该溶液200 μL(3 μmol)，加入10 μL乙酸，混匀。向其中加入NaI·H2O(1.7 mg，9 μmol)，然后加入Iodogen(1.0 mg，2 μmol)。室温振荡4 min后加入200 μL饱和NaHSO3溶液终止反应。将反应混合物用2 mL水稀释，然后用氟固相萃取(F-SPE)柱纯化。使用前F-SPE柱先用6 mL水淋洗，再用80%的甲醇-水溶液淋洗。产物纯化时先用6 mL水洗脱，再用80%甲醇-1 mol/L乙酸溶液洗脱即可得到产物MIBG。对纯化后的产物进行质谱分析和HPLC分析。

图2 模拟标记Fig.2 Non-radioactive iodination

2.3 n.c.a.[125I]MIBG的制备

将标记前体3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)锡苄胍溶于甲醇，制成5 g/L的溶液。向涂有Iodogen(20 μg，0.5 g/L)的反应管中加入该溶液100 μL(5 g/L)和5 μL乙酸，混匀。然后向其中加入Na125I溶液100 μL(48.1 MBq)，室温振荡4 min后加入100 μL饱和NaHSO3溶液终止反应。用Waterman滤纸为支持体，V(正丁醇)∶V(乙醇)∶V(氨水)(2 mol/L)=6∶1∶2为展开剂进行TLC分析，计算标记率。

将反应混合物用1 mL水稀释，然后用氟固相萃取柱纯化。先用6 mL水洗脱，再用6 mL 80%甲醇-1 mol/L乙酸溶液洗脱即可得到产物n.c.a.[125I]MIBG。纯化后产物的放化纯度用HPLC进行分析和计算。

2.4 n.c.a.[125I]MIBG在小鼠体内的生物分布

昆明小鼠25只，随机分成5组。尾静脉注射0.1 mL n.c.a.[125I]MIBG(约2.4×105Bq)，分别在注射0.5、1 、4、8、24 h后处死，取血、甲状腺、心、肝、脾、肺、肾上腺、和肾等器官和组织，称重并用γ-计数器测量放射性计数，然后计算单位组织的放射性摄取百分比。按相同方法进行c.a.[125I]MIBG的生物分布研究。

3 结果与讨论

3.1 标记前体的合成

中间产物化合物2：产量为187 mg，产率27%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 7.37(m，3H)，7.30(m, 1H)，3.90(s，2H)，2.31(m，6H)，1.84(bs，2H)，1.31(t，6H)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ 143.73，136.85，134.81，134.54，129.16，128.58，46.56，27.82，-1.36；MALDI-TOF：1268.2(M+H)+。

终产物3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)锡苄胍(化合物3)：产量为96 mg，产率为93%。1H NMR(400 MHz，CD3OD)：δ 7.52～7.36(m，4H)，4.43(s，2H)，2.42(m，6H)，1.37(t，6H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)：δ 158.78，139.93，137.83，136.97，136.11，130.10，129.20，46.09，28.73，-0.48；MALDI-TOF：1 310.4(M+H)+。

目前，固体聚合物作为标记前体支持体[15]和多氟化合物作为标记前体支持体[20]不必使用HPLC进行纯化，在标记前体的结构中引入较大相对分子质量化合物作为支持体，在标记过程中目标产物[*I]MIBG可以从支持体上脱离下来。利用支持体本身的特点通过简单的柱分离对标记产物进行纯化，该过程不需要相对复杂的HPLC系统，有利于n.c.a.[*I]MIBG的大规模制备和临床应用。采用多氟化合物作为标记前体支持体进行标记前体的合成，由于该化合物是可溶性的，能够利用传统分析技术对中间体和最终化合物进行纯化和鉴定，更有利于得到高纯度的标记前体。

3.2 模拟标记

由HPLC分析结果(图3、图4和图5)可知，在相同实验条件下模拟标记产物的保留时间与MIBG标样的保留时间一致(Rt=4.3 min)。结合质谱鉴定为(两者的分子离子峰均为276.0(M+H)+)目标产物MIBG。同时从模拟标记产物的HPLC谱图上可以看到在Rt=6.2 min处有少量杂质，通过面积计算可以得出目标产物的纯度约为98%，达到了进行标记实验的要求。

图3 模拟标记产物的HPLC谱图Fig.3 UV HPLC chromatogram of non-radioactive iodination product

图4 MIBG标样的HPLC谱图Fig.4 UV HPLC chromatogram of standard MIBG

图5 模拟标记产物和MIBG标样混合样品的HPLC谱图Fig.5 UV HPLC chromatogram of non-radioactive iodination product and standard MIBG

3.3 放射性碘标记

TLC分析结果显示产物的标记率大于90%。HPLC分析表明(图6)，标记产物经F-SPE柱纯化后n.c.a.[125I]MIBG的放化纯度大于98%，放化产率约80%。说明对该标记前体进行放射性碘标记后，通过简单的氟固相萃取柱分离就可以对标记产物进行纯化，符合进行生物实验的要求。由此可见，与普通方法相比，该方法不需要使用HPLC分离即可得到高纯度的n.c.a.[*I]MIBG，可以在短时间内制备较大量的n.c.a.[*I]MIBG，更有利于n.c.a.[*I]MIBG的临床研究及应用。

3.4 n.c.a.[125I]MIBG在小鼠体内的生物分布

为了比较n.c.a.[125I]MIBG和c.a.[125I]MIBG在正常生物体内的分布信息，同时进行了n.c.a.[125I]MIBG和c.a.[125I]MIBG在正常小鼠体内的生物分布实验，结果分别如表1和表2所示。并对n.c.a.[125I]MIBG和c.a.[125I]MIBG两组数据进行了统计学分析。

图6 n.c.a.[125I]MIBG的HPLC分析图谱Fig.6 γ-HPLC chromatogram of n.c.a.[125I]MIBG

表1 n.c.a.[125I]MIBG在正常小鼠体内的生物分布Table 1 Biodistribution of n.c.a.[125I]MIBG in normal mice

注：1) P<0.05，2) P<0.01

表2 c.a.[125I]MIBG在正常小鼠体内的生物分布Table 2 Biodistribution of c.a.[125I]MIBG in normal mice

从表1和表2可以看出，n.c.a.[125I]MIBG和c.a.[125I]MIBG在正常小鼠的心、脾、肺和肾上腺中的分布存在显著性差异，且n.c.a.[125I]MIBG的心/肝、心/肺放射性摄取比也高于c.a.[125I]MIBG，该结果与文献报道一致[14]。说明n.c.a.[125I]MIBG的高比活度(约81.4 GBq/μmol比c.a.[125I]MIBG的比活度高出104～105倍)使含有肾上腺受体的器官中的放射性摄取提高，同时也提高了心肌和临近器官(肝、肺)的比值。从理论上来说，n.c.a.[123I]MIBG可以提高c.a.[123I]MIBG的显像质量[4-9,13]，n.c.a.[131I]MIBG可以增强治疗效果[9-12]，降低[131I]MIBG的副作用，并能快速给药。因此，无载体放射性碘标记MIBG可能在临床诊断和治疗方面存在很大优势。目前临床研究的结果支持n.c.a.[123/131I]MIBG的临床应用，但是还需要进一步的临床试验证明其有效性是否与c.a.[123/131I]MIBG不同以及提供安全性方面的信息。

4 结论

本研究利用多氟化合物支持体成功制备了n.c.a.[125I]MIBG的标记前体，并进行了放射性碘标记和初步生物分布研究。HPLC分析表明，标记产物经氟固相萃取柱纯化后n.c.a.[125I]MIBG的放化纯度大于98%。由于该方法不需要使用HPLC分离即可得到高纯度的n.c.a.[*I]MIBG，可以在短时间内制备较大量的n.c.a.[*I]MIBG，更有利于n.c.a.[*I]MIBG的临床研究及应用。

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Preparation and Preliminary Biodistribution of No-Carrier-Added Meta[*I] iodobenzylguanidine

FAN Cai-yun, DENG Xin-ring, LIU Zi-hua, LI Feng-lin, LUO Zhi-fu

(ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China)

No-carrier-added meta-[*I]iodobenzylguanidine((n.c.a.)[123/131I]MIBG) has been considered to be promising diagnostic agents for oncology and cardiology, or as targeted radiotherapeutics for neuroendocrine tumors. The synthesis of a fluorous supported precursor for the purification without HPLC of n.c.a.[*I]MIBG was presented and its structure was determined. The precursor was labeled with radioactive iodine and the preliminary biodistribution of n.c.a.[*I]MIBG was studied. The uptake of n.c.a.[125I]MIBG were significantly higher than that of c.a.[125I]MIBG in heart, spleen, lung and adrenals. This facile preparation method of n.c.a.[*I]MIBG would allow its wider application in clinic.

MIBG; no-carrier-added; fluorous supported; radioactive iodine labeling

10.7538/tws.2015.28.03.0148

2015-03-31;

2015-05-11

樊彩云(1977—)，女，河南浚县人，副研究员，放射性药物专业

罗志福,研究员,博士研究生导师，E-mail: luozhifu@ciae.ac.cn

TL92+3

A

1000-7512(2015)03-0148-07