中药异位宁对子宫内膜异位症大鼠Bcl-2、Fas、Caspase-3信号传导通路的影响

孙可丰，李娜，时思毛，赵颜，杨德芳，冯晓玲

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

子宫内膜异位症(endometriosis，EM，简称内异症)多发于育龄期女性，临床表现以痛经、下腹痛和性交痛为主，其发病率逐年上升，近几年可达10%～15%，占普通妇科手术的30%以上。近年来，内异症引起的不孕症也成为了研究热点之一，严重地影响了妇女的生活质量及身心健康。无生育要求的内异症患者以减灭和消除病灶，减轻和消除疼痛，减少和避免复发为主要治疗原则［1-2］。鉴于内异症的手术治疗效果不甚理想，术后又易于复发，有生育要求患者应谨慎选择手术治疗，因此，药物治疗仍占重要地位［3］。本研究通过探讨中药复方异位宁对Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白表达的影响来阐述异位宁治疗子宫内膜异位症的作用机制，为其推广应用提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

Wistar雌性大鼠，8～12周龄，未孕，体质量(200±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，微生物控制等级一级。

1.2 实验药物

中药复方异位宁:赤芍15g，金银花20g，延胡索20g，莪术10g，蜈蚣1条，牡蛎15g，薏苡仁15g，柴胡20g，由黑龙江中医药大学门诊药局统一煎制提供。达那唑:200mg/粒，江苏联环药业股份有限公司，批号20010101。

1.3 实验试剂

大鼠Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白检测试剂盒及免疫组化染色试剂盒，均由武汉博士德生物工程公司提供。

2 实验方法

2.1 EM 大鼠模型制备方法

乙烯雌酚0.2mg/只皮下注射促情，麻醉后无菌条件下开腹，分离并结扎右侧子宫，取中段2cm，纵形剪开，剥离宫内膜，剪成等大3块，分别缝合于子宫交叉处、左侧卵巢、左侧腹膜壁层，术毕，关腹。每只大鼠术后每日腹腔注射庆大霉素0.1ml，共3天。

2.2 分组及给药

模型制备后正常饲养1个月，随机分为五组，异位宁高剂量组(n=10)每日5.4g/100g异位宁灌胃;异位宁低剂量组(n=10)每日1.8g/100g异位宁灌胃;西药组(n=11)，每日3.6g/100g达那唑混悬液灌胃;正常对照组(n=11)不予任何处理;模型组(n=9)每日以等量生理盐水灌胃;五组大鼠均灌胃1个月。

2.3 切片及染色、Western-Blot

灌胃结束后，大鼠眶后取血，断髓处死，解剖获取大鼠正常对照组在位子宫内膜，及其余各组大鼠子宫交叉处的异位子宫内膜，常规石蜡包埋，切片，采用免疫组化法，常规处理后显微镜观察。Western-Blot法:提取获得组织之蛋白，按照蛋白印迹实验步骤严格操作。

3 实验结果

3.1 实验造模结果

造模术后饲养1个月，随机抽取8只大鼠二次开腹。可见:移植宫内膜体积增大，部分增大物内含液性物体;或由结缔组织包裹，腹壁、大网、肠管广泛粘连，说明动物模型制备成功。

3.2 HE染色光镜下观察结果

由图1可见，异位宁高剂量组:在位内膜组织形态无显著变化，腺体结构完整，腺上皮排列紧密、整齐，异位内膜组织腺体数目减少、腺腔萎缩，血管数目减少，腺腔内无炎性渗出物蓄积，间质细胞细小而稀疏。

异位宁低剂量组:在位内膜组织腺腔形态无明显改变，异位内膜腺体数目减少，腺腔变小，腺上皮萎缩。间质细胞数量、体积均减小。

空白组:正常在位子宫内膜厚度如常，腺体数量如常，分布均匀，间质细胞大小如常、分布均匀、腺体完整，腺上皮细胞排列整齐，高柱状，可见核下空泡和顶浆分泌。

模型组:异位内膜呈锯齿封闭式结构或子宫腔状，腺体数目较正常组明显减少，间质细胞较细长，内含丰富血管，腺上皮细胞增生，有少数腺体扩散，腔内蓄有炎性渗出物，周围纤维增生包裹。

3.3 各组大鼠内膜Bcl-2、Fas、Caspase-3表达

3.3.1 免疫组化判断标准

根据染色强度及阳性细胞比例行半定量判定。阳性染色:细胞浆内见棕黄色颗粒染色，即判定为阳性，染色强度标准:0分为阴性;强于阴性但染色弱者1分;中等强度染色2分;强染色3分。染色阳性细胞比例评定标准:阴性0分，阳性细胞数＜5%;弱阳性1分，阳性细胞数5%～25%;阳性2分，阳性细胞数为26%～50%;强阳性3分，阳性细胞数为51%～75%;非常强阳性4分，阳性细胞数75%以上。其阳性积分为二者评分相加。

实验结果显示:模型组Bcl-2阳性表达较正常组增高，有显著性差异(P＜0.01);高、低剂量组与模型组相比(P＜0.01)，说明异位宁能够降低Bcl-2表达;西药组(达那唑组)与模型组相比(P＜0.01)，说明异位宁高、低剂量组可降低Bcl-2的表达，疗效较达那唑组显著，有极显著性差异(P＜0.01)，说明中药异位宁在降低Bcl-2阳性表达方面较西药达那唑疗效显著。

模型组Fas、Caspase-3阳性表达增高，与正常组相比有显著性差异(P＜0.01);高、低剂量组与模型组相比(P＜0.01)，异位宁可升高Fas、Caspase-3阳性率的表达。西药组(达那唑组)与模型组相比(P＜0.01)，亦可能激活Fas、Caspase-3的表达，结果见表1。

图1 HE染色光镜下观察结果

表1 各组大鼠内膜组织中Bcl-2、Fas、Caspase-3表达()

表1 各组大鼠内膜组织中Bcl-2、Fas、Caspase-3表达()

注:与正常组相比，#P＜0.01;与模型组相比，*P＜0.01;与西药组相比，▲P＜0.01。

组别n Bcl-2 Fas Caspase-3正常组11 1.54±0.76 1.36±0.84 1.44±0.84模型组 9 5.10±1.46#▲ 2.26±1.12＊▲ 2.14±1.28*▲异位宁高剂量组10 2.06±1.32＊▲ 5.07±1.26#▲ 5.12±1.38#▲异位宁低剂量组10 2.43±1.34＊▲ 3.01±1.23＊▲ 3.10±1.15＊▲西药组 11 3.11±1.13* 2.23±1.44* 2.38±1.42*

3.3.2 Western-Blot结果

各组大鼠内膜组织中Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白印记表达结果显示(见图2)，异位宁高剂量组及低剂量组两组与模型组相比，Bcl-2蛋白表达量均显著降低(P＜0.01)，而Fas、Caspase-3蛋白表达量则增高(P＜0.01)。实验结果表明，异位宁能够降低Bcl-2表达，增加Fas、Caspase-3表达，促进异位内膜细胞的凋亡能力，限制于宫腔外种殖的异位内膜细胞的存活能力，使病灶萎缩，最终达到治疗目的。同时提示药物浓度对Bcl-2、Fas、Caspase-3的表达可能有影响，但有待进一步研究验证。

图2 Western-Blot结果

4 讨论

细胞凋亡是通过凋亡信号转导途径，而启动细胞内死亡机制，最后导致细胞的程序性变性和坏死的过程。其基本过程是诱导因子刺激细胞表面，信号传入，而激活内源性脱氧核糖核酸，从而导致细胞的自然死亡。此过程参与有机体的发育生殖、老化、免疫等生理过程，增殖性疾病、肿瘤、自身免疫疾病等多种疾病的发生发展均与此关系密切。

4.1 Bcl-2在EM中的作用

细胞凋亡由许多癌基因和抑癌基因调控，Bcl-2基因家族在其中占据重要地位。Bcl-2基因家族是一组具有同源结构域(BH)基因，已发现有超过20的Bcl-2家族成员，由于BH成分的差异，Bcl-2家族成员的生物学功能不同，Bcl-2家族分为以下两组:第一、抗凋亡成员，如Bcl-2，Bcl XL，Bcl-w等;第二、如Bax，Bak，Bid等则属于促凋亡成员。研究表明，体内Bcl-2家族发挥作用的形式为二聚体。抗凋亡成员主要分布于线粒体外膜，并与促凋亡成员BH3结构域相互作用，在细胞凋亡中发挥作用，抑制细胞凋亡。

凋亡抑制基因Bcl-2相关蛋白主要存在于核膜和内质网及线粒体膜上。许多正常组织及肿瘤组织中均有Bcl-2的表达，但除外淋巴组织，该基因若过度表达，可以防止或延迟正常细胞分化，延长细胞的寿命，增加细胞的数量，而引起肿瘤或增殖性疾病。在月经周期中，细胞凋亡及其调控基因在子宫内膜周期性变化中起重要作用。Bcl-2在正常子宫内膜中的增殖期表达增加，Bas亦上升，Bcl-2/Bas比值维持相对平衡，减少在正常子宫内膜腺上皮细胞通过线粒体途径引起的细胞凋亡，从而使内膜正常增殖及修复;而分泌期Bcl-2表达则急速下调，BAS转移到线粒体与Bcl-2结合，Caspase激活，而使Bcl-2持续高表达，而得以逃避凋亡，利于子宫内膜的修复。有报道称，EM中Bcl-2在异位内膜中强表达，且无明显周期性变化，增殖期、分泌期均强表达，与正常子宫内膜及非异位内膜中存在显著差异。

4.2 Fas在EM中的作用

Fas在介导细胞凋亡中是一个重要膜蛋白分子。研究表明，Fas介导的子宫内膜细胞凋亡，可能是子宫内膜病变发生的关键。本研究发现，Fas主要于子宫内膜腺细胞和/或胞浆中表达。大量研究发现，Fas表达在子宫内膜中减少，则免疫细胞(如NK细胞)无法有效去除Fas阳性的免疫细胞，反诱导细胞凋亡产生主动免疫耐受过程，导致逆流到盆腔的子宫内膜细胞逃脱免疫监视，活性高而利于异位植入成活，促进子宫内膜异位症的发生。因此，提示Fas/FasL诱导的细胞凋亡途径是其共同发病机制。

4.3 Caspase-3在EM中的作用

细胞凋亡是各种死亡信号激活后，细胞死亡的主动过程。Caspase-3家族在诱导细胞凋亡的分子机制中作用关键，为多条凋亡途径的关键点，是细胞凋亡的最终途径。大量的研究已经证实，Caspase-3是Caspase家族中与凋亡最密切的基因，因其位于两条细胞凋亡信号通路的中心，直接参与细胞凋亡过程，导致细胞凋亡，因此，Caspase-3能够反应细胞凋亡的程度。

以上我们可以看出，Bcl-2的高表达及Fas、Caspase-3的低表达可下调异位内膜的凋亡率，使细胞周期延长。而异位内膜细胞正是因为三者蛋白表达的改变，使其凋亡率远低于正常子宫内膜及EM的在位内膜，并延长了异位内膜细胞生长周期，故异位病灶可以不断发展。

根据我们的实验结果显示，异位宁高剂量组及低剂量组可显著降低Bcl-2阳性表达率，升高Fas、Caspase-3阳性表达率，说明异位宁能够降低Bcl-2表达，增加Fas、Caspase-3表达，增强宫腔外种植的异位内膜细胞的凋亡能力，同时减弱异位内膜细胞的存活能力，使病灶萎缩，最终达到治疗目的。可以预见，中药异位宁作为作为Bcl-2、Fas、Caspase-3选择性抑制剂将会更广泛地应用到临床，为中药异位宁治疗子宫内膜异位症的机理研究提供了新的思路。

［1］郎景和.子宫内膜异位症的研究与设想［J］.中华妇产科杂志，2003，38(8):478-480.

［2］马小娜，闫军堂，任国辉，等.子宫内膜异位症中医病因病机的认识探讨［J］.中医药学报，2012，40(3):63-66.

［3］周应芳.子宫内膜异位症的临床诊断和治疗［J］.中华妇产科杂志，2005，40(1):67-70.