HPLC同时测定不同产地甘松中绿原酸和甘松新酮的含量

李艳忙，刘国林，乔晶，刘爽，张瑜，秦振娴，刘勇

(北京中医药大学，北京 100102)

甘松为败酱科植物甘松(Nardostachys chinensis DC.)的干燥根及根茎，具有理气止痛，开郁醒脾等功效，多用于治疗脾胃气滞、霍乱转筋、脘腹胀痛、牙痛、痰眩、癔病癫痫、心悸怔忡、脚气等［1］。甘松被列为我国二级保护藏药，用药历史悠久，主要分布于甘肃、青海、四川、云南西北部、西藏等地［2］。甘松中倍半萜类成分是甘松开郁醒脾的有效成分，其中，甘松新酮是甘松中特有成分，生物活性研究表明，甘松新酮具有镇静、抗抑郁及促进神经细胞生长等活性［3-9］;现代药理研究表明，甘松可以治疗慢性胃炎、胃溃疡、脚气等症，而甘松中绿原酸具有抗菌消炎的活性［10-11］，是甘松抗菌消炎的物质基础。为了保证甘松的药材质量和更好的应用于临床治疗，笔者在前期研究基础上采用HPLC法建立同时测定甘松中绿原酸和甘松新酮含量的方法，并对25个产地的甘松进行初步研究分析，以期为药典中甘松药材增加甘松新酮的含量测方法、甘松资源的开发利用和药材的质量控制提供科学和全面的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

甘松药材(25个产地的样品，于2013年7～8月份采自四川青海等地，经北京中医药大学中药学院石晋丽教授鉴定为败酱科植物甘松);绿原酸对照品(中国生物制品药品检定所，供含量测定用，批号RA0426FA14);甘松新酮(自制，含量大于98%);Waters 2695高效液相色谱仪(配DAD检测器);Sartofius—BSll0S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);KQ-5200E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);乙腈(色谱纯，Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm，美国Agilent公司)，流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液。线性梯度洗脱，0～5min，A 10%;5～15min，A 10%～15%;15～22min，A 15%～30%;22～32min，A 30%～35%;32～40min，A35%～50%;40～50min，A 50%～65%;50～60min，A 65%。柱温为25℃;检测波长为274nm;流速为1.0mL/min。

1.2.2 对照品溶液的配制

精密称取干燥至恒重的绿原酸对照品4.26mg，甘松新酮对照品7.24mg，用甲醇配制成浓度分别为0.1704mg/mL、0.2896mg/mL的对照品储备液。分别精密移取绿原酸对照品储备液9mL，甘松新酮对照品储备液15mL，混匀，配制成浓度分别为62.6μg/mL、177.3μg/mL的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的配制

称取各产地的甘松药材粉末(过20目筛)约2g，精密称定，置于100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，密封后在室温下超声1h，提取2次，过滤后合并提取液，浓缩，最后用甲醇定容至25mL容量瓶内，取续滤液经微孔滤膜(0.45μm)过滤，即得供试品溶液。

1.2.4 线性关系考察

高效液相色谱仪分别精密进样2，5，10，20，30，50μL混合对照品溶液，在“1.2.1”项色谱条件下测定，记录色谱图。以峰面积(Y)为纵坐标，进样量为横坐标(X)，绘制标准曲线，并进行线性回归。

1.2.5 精密度考察

在“1.2.1”项色谱条件下连续进样对照品溶液6次，每次10μL，记录色谱峰面积，计算仪器精密度。

1.2.6 重复性试验

选取四川阿坝县河支乡的甘松样品为供试品，精密称取6份样品，按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.1”项色谱条件下进样测定，计算绿原酸、甘松新酮的峰面积的RSD值，以评价方法的重现性。

1.2.7 稳定性试验

取同一份甘松样品，在室温下放置，分别在0，2，4，8，12，24h进样10μL测定分析，记录色谱峰面积，计算绿原酸和甘松新酮的RSD，以评价供试品溶液的稳定性。

1.2.8 加样回收率试验

称取已知含量(绿原酸、甘松新酮)的四川阿坝县河支乡的甘松样品6份，每份约2g，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.1”项色谱条件下测定，计算回收率和RSD值。

1.2.9 甘松样品含量的测定

取不同产地的甘松药材粉末，按“1.2.3”项下方法配制样品溶液，在“1.2.1”项色谱条件下进样分析，测定绿原酸和甘松新酮的峰面积，以外标法计算两种成分在甘松样品中的含量。

2 结果

2.1 对照品与供试品溶液的色谱分析结果

对照品及供试品溶液的色谱图见图1。由图1可知，理论塔板数按绿原酸、甘松新酮和隐丹参酮计算均不低于5000，且三者分离度均大于1.5，分离效果好。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察

绿原酸的线性回归方程为Y=755732X-27119，r=0.9993(n=6);甘松新酮的线性回归方程为Y=368527X-8160，r=1(n=6)。结果表明绿原酸在0.1278～3.195μg，甘松新酮在0.3546～8.865μg范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验

绿原酸峰面积的RSD为2.61%，甘松新酮峰面积的RSD为1.04%。结果表明仪器精密度符合要求。

2.2.3 重复性试验

图1 对照品和供试品HPLC图

由实验结果可知，绿原酸、甘松新酮的RSD分别为1.67%、1.04%。结果表明本方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验

绿原酸峰面积的RSD为2.02%，甘松新酮峰面积的RSD为2.18%。结果表明样品溶液在24h内稳定。

2.2.5 加样回收率试验

绿原酸、甘松新酮的平均回收率分别为99.2%，101.1%，RSD分别为1.73%，1.10%，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.3 样品中绿原酸、甘松新酮的含量测定

按照“1.2.9”方法测定样品中绿原酸、甘松新酮的含量，结果见表2。由表2可知，绿原酸含量在0.026%～0.355%，甘松新酮的含量在0.109%～2.013%。

表2 不同产地甘松药材中绿原酸、甘松新酮的含量(n=2)

3 讨论

3.1 提取方法的选择

本实验以绿原酸和甘松新酮为指标性成分，分别以甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇作为提取溶剂，采用超声提取法和加热回流提取方法提取，并对提取时间(30min，1h)和提取次数进行考察，结果表明，超声提取法甘松新酮的含量明显高于加热回流法，两种方法提取的绿原酸含量并无明显差异。超声法操作简单，快速，故提取方法确定为样品加入甲醇100mL超声提取1h，提取2次。

3.2 检测波长的选择

对绿原酸和甘松新酮两个对照品的甲醇溶液进行全波长扫描，扫描波谱显示绿原酸最大吸收波长为330nm，甘松新酮最大吸收波长为254nm，为使两种成分在同一波长下均有吸收，故本文选择274nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择

本实验以甲醇-水为流动相，存在拖尾现象，因此在流动相加磷酸以改善拖尾现象，在此基础上比较了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水等洗脱溶剂，并比较了流速分别为0.8mL/min和1.0mL/min时两种化合物的分离度，最终确定了流速为1.0mL/min时，两种成分与杂质峰分离度良好的乙腈-0.1%磷酸水作为流动相进行梯度洗脱。

3.4 结果分析

本实验建立了甘松中绿原酸和甘松新酮的含量的测定的分析方法，并采用此方法对25个产地的甘松药材进行了含量测定。结果表明，绿原酸含量在0.026%～0.355%，甘松新酮的含量在0.109%～2.013%。由此可见，不同产地的甘松药材含量差异较大，四川红原县的甘松新酮的含量高达2.013%，四川松潘县山巴乡的甘松中绿原酸含量高达0.355%，甘肃4个产地的甘松药材中两种成分的含量均较高，四川不同产区的甘松药材含量有较大差异，可能是受生长的土壤、生长年限、采收季节和贮存时间等因素有关。本实验采用高效液相法对不同产地的甘松药材中绿原酸、甘松新酮的含量进行比较分析，为甘松药材的质量控制规范化、标准化提供参考依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:79-80.

［2］万新，石晋丽，刘勇，等.甘松属植物化学成分与药理作用［J］.国外医药(植物药分册)，2007，22(1):1-6.

［3］Surendra Kumar Sharma，Ajay Pal Singh.In Vitro Antioxidant and Free Radical Scavenging activity of Nardostachys jatamansi DC［J］.Journal of Acupuncture and Meridian Studies，2012，5(3):112-118.

［4］李琴.甘松新酮抗抑郁作用以及作用机制初探［D］.北京:北京中医药大学，2011.

［5］武姣姣，石晋丽，唐民科，等.甘松对动物行为绝望模型的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(7):205-207.

［6］Liu Jian-hui，Yin Fei，Zheng Xu-xu.Nardostachys chinensis Glycoside Induces Characteristics of Neuronal differentiation in Rat Pheochromocytoma PC12 Cells［J］.Biol Pharm Bull，2005，28(4):768-771.

［7］Li Ping，Kimihiro Matsunaga.Nardosinone，the firstenhancer of neurite outgrowth-promoting activity of staurosporine and dibutyryl cyclic AMP in PC12D cells［J］.Developmental Brain Research，2003，1(45):177-183.

［8］李玮，石晋丽，李琴，等.甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用［J］.药学学报，2013，48(9):1422-1429.

［9］张盼，程光宇，程为平.浅谈甘松的临床应用［J］.中医药学报，2015，43(2):99-100.

［10］刘颖，郭明晔.绿原酸的研究进展［J］.中药材，2012，35(7):1180-1185.

［11］何跃，杨松涛，唐建军，等.甘松不同提取成分组合给药预防大鼠急性胃炎的实验研究［J］.实用医院临床杂志，2011，8(1):27-29.