补脑止痫散对癫痫大鼠脑组织相关细胞因子IL-2、IL-6蛋白表达的影响

冯铁为，程为平，孙丽

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;3.大庆市龙南医院，黑龙江 大庆 163453)

癫痫作为一种具有与免疫系统相关的神经系统疾病，已日渐成为影响人类健康的一大疾患。有研究发现在其发病过程中因诸多细胞因子参与了细胞免疫调节而致痫。中药复方补脑止痫散由制首乌、石斛、天麻、僵蚕等组成。本实验研究通过观察中药复方对致痫后大鼠细胞因子IL-2、IL-6的影响来观察中药复方治疗癫痫的效果，为该方在临床中对癫痫疾病的治疗及预防提供重要的实验依据。

1 资料与方法

1.1 动物

实验共用80只大鼠，均来自于黑龙江中医药大学实验动物中心提供的符合条件的健康雄性Wistar大鼠，体质量180～220g，自由摄食、饮水1周，随机选取10只用于实验中的空白对照组。其余70只用于戊四氮诱导大鼠致痫，待大鼠成功点燃后用于下一步实验。

1.2 方法

1.2.1 分组

实验共分6组。将致痫成功的大鼠随机分成5组，分别为癫痫模型组、补脑止痫散低剂量治疗组、补脑止痫散中剂量治疗组、补脑止痫散高剂量治疗组、丙戊酸钠治疗组，空白对照组。

1.2.2 受试药物

中药补脑止痫散(由制何首乌、石斛、天麻、僵蚕、全蝎、远志、甘松七味中药组成，各药混合为末，药材购于江阴天江药业有限公司生产的颗粒剂);丙戊酸钠缓释片(江苏恒瑞医药股份有限公司);戊四氮(美国Sigma公司)。

1.2.3 给药方法

实验空白组和癫痫模型组给予一定量的生理盐水灌胃，其他各治疗组均给予相应的药物灌胃治疗。给予药物的剂量按正常成人(70Kg)与大鼠给药剂量系数(0.018)折算:丙戊酸钠换算为灌胃剂量为157.5mg/kg，补脑止痫散高、中、低剂量组分别按1.6g/kg、0.8g/kg、0.4g/kg的标准配成溶液，每天上午选择固定时段对大鼠进行灌胃给药1次，连续灌胃6周。实验期间各组均自由摄食、饮水。

1.3 观察指标

采用免疫印迹(Western blot)的方法测定IL-2、IL-6的蛋白阳性表达。

在液氮冷冻条件下提取蛋白后，采用Bradford方法确定待测样品的蛋白含量。将待测的样品和样品缓冲液按1∶5的比例混匀后放在水中煮，待水沸腾后煮至5min停止，放在室温下冷却备用。把电泳缓冲液倒入电泳装置中，于100V电泳至溴酚兰前沿到达分离胶底部0.5cm时，停止电泳。按照凝胶大小剪取适合的滤纸、PVDF膜，置于转膜液中浸透。低温60mA电转移1～1.5h。取下纤维素膜，做好标记，将膜用TBST缓冲液洗3次。在避光的条件下，逐渐加入碱性磷酸酶的特异性底物溶液至出现清晰的特异性条带后停止，然后立即将膜浸入到去离子水中，漂洗几分钟即可。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织中海马IL-2蛋白光度比的比较

由表1可知，模型组IL-2蛋白阳性表达与正常对照组比较显著增加(P＜0.01);中药高、中、低剂量组、西药组的IL-2蛋白阳性表达均明显降低于模型组(P＜0.05)，但和空白组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 各组大鼠脑组织中海马IL-2蛋白光度比的比较()

表1 各组大鼠脑组织中海马IL-2蛋白光度比的比较()

注:与空白组比较，※P＜0.01;与模型组比较，▲P＜0.05，★P＜0.01。

组别n IL-2/GAPDH空白组 10 1.0087±0.0847★模型组 10 1.7135±0.5261※西药组 12 1.0212±0.0571▲中药低剂量组 11 1.1571±0.2637▲中药中剂量组 12 1.0542±0.1897▲中药高剂量组 13 1.0324±0.1982▲

2.2 各组大鼠脑组织中海马IL-6蛋白光度比的比较 见表2。

表2 各组大鼠脑组织中海马IL-6蛋白光度比的比较()

表2 各组大鼠脑组织中海马IL-6蛋白光度比的比较()

注:与空白组比较，※P＜0.01;与模型组比较，★P＜0.01。

组别n IL-6/GAPDH空白组 10 1.0178±0.0996★模型组 10 2.6378±0.0780※西药组 12 1.6184±0.0753▲中药低剂量组 11 2.6378±0.1041◆中药中剂量组 12 1.6796±0.0896▲中药高剂量组 13 1.5456±0.1027▲

由表2可知，模型组大鼠海马区的IL-6蛋白阳性表达比空白组显著增加(P＜0.01);中药高、中剂量组、西药组大鼠海马区IL-6蛋白的阳性表达和模型组比较明显降低，(P＜0.05);中药低剂量组蛋白的阳性表达与模型组相比无明显差异，统计学上无意义(P＞0.05)，从数值上看，西药组与中药高剂量组的疗效无明显差异。

3 讨论

癫痫病是临床常见的神经系统疾病之一，其发病特点为症状复杂，病程长，易反复发作。目前西医控制癫痫的主要手段仍然是药物治疗，而癫痫患者需长期服药，而多数的抗癫痫西药均存在毒副作用，使得癫痫患者长期遭受疾病和药物不良反应的双重痛苦。中医在治疗癫痫病方面有着悠久的历史，积累了丰富的经验，能够从人体的整体机能状态出发，无论针对癫痫复杂的病理机制进行辨证治疗还是辨病治疗上均有其独特的疗效和优势。

本课题根据博士后导师程为平教授30年的临床经验，结合传统中医理论，创立了以补脑益髓为主，熄风化痰开窍安神为辅的治疗癫痫之方补脑止痫散。方中制何首乌为君药，有补益精血、固精益肾、乌须之功效。《本草正义》载其“专入肝肾，补养真阴”。现代药理学研究发现何首乌中含有GABA，并且含量较为可观，可抑制癫痫的发生，并具有补肝肾及镇静安神和降血脂作用［1］;石斛具有益胃生津、滋阴清热的功效。何首乌与石斛相配伍，能达到补益肝肾、填精补髓的功效;天麻可以熄风止痉、祛外风，通经络，《开宝本草》云:天麻“主诸风湿痹，四肢拘挛，小儿风痫、惊气……”。天麻有“治风之神药”之称，现代药理学研究发现天麻的主要成份天麻素能抑制兴奋性神经递质Glu的释放［2］。全蝎含蝎毒，现代药理研究已证实全蝎含有的蝎毒是抗癫痫的主要有效部位，而且还有作用更强的抗癫痫肽(AEP)可从蝎毒中分离出来，而AEP的抗癫痫作用依赖于单胺类神经递质的释放［3］。僵蚕性平，可熄风止痉、祛风止痛、化痰散结，《本经》载其“主小儿惊痫……”因其既能熄风，又能化痰，故为临床治疗癫痫的常用药。远志具有安心益智、祛痰开窍的功效。现代药理学研发究现远志有镇静、抗惊厥、抗痴呆和脑保护(开窍)的作用［4］。《药品化义》记有:远志，“入心开窍，宣散之药。凡痰涎伏心，壅塞心转……暂以豁痰利窍，使心气通，则神魂自宁也。”本品对癫痫诸症具有既安神又开窍双向调节之功。甘松辛甘、性温，可行气止痛、开郁醒脾安神。现代药理学证明甘松能有效延长大鼠惊厥潜伏期，减少发作持续时间和次数，降低痫性发作程度，并且可以减少癫痫发作所造成的神经功能损伤、认知功能障碍［5-6］。甘松与远志合用能安神止痫。全方七味药共奏补脑益髓，熄风化痰开窍安神之效。

在中枢神经系统内有多种细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-6、TNF等，均是由胶质细胞和神经元分泌的，这些细胞因子都可以参与到癫痫的放电活动中［7］。本次实验通过对IL-2、IL-6两种细胞因子的研究，发现中药复方补脑止痫散可能是通过降低大鼠脑组织海马区的IL-2、IL-6蛋白的含量，改变中枢神经系统的兴奋性，抑制癫痫的发作，对脑神经起到保护和营养的作用的。

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［2］薛柳华，唐一鹏，洪庆涛，等.天麻素对谷氨酸致培养皮层神经细胞损伤的保护作用［J］.北京中医药大学学报，1999，22(1):39-40.

［3］于家琨，张景海，王起振，等.东亚钳蝎毒抗癫痫肽作用机制研究［J］.沈阳药学院学报，1993，10(1):55-59.

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［5］丁莉，李新玲，邵良.甘松对青霉素致痫大鼠行为学表现及脑电图的影响［J］.癫痫与神经电生理学杂志，2010，19(3):132-135.

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［7］Wang S，Cheng Q，Malike S，et al.Interleukin-1beta inhibits gamma-aminobutyric acid type A［GABA(A)］receptor current in culutured hippocampus neurons［J］.J-Pharmacol-Exp-Ther，2000，292(2):497-504.