蓬子菜中香叶木苷对急性血瘀及血管内皮功能影响的实验研究

董坤，寇韩旭，宁馨，孙超，马英丽

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

蓬子菜(Galium verum L.)为茜草科(Rubiaceae)拉拉藤属(Galium)药用植物。实验证明，蓬子菜中化学成分主要为黄酮、蒽醌及环烯醚萜类，其中黄酮类成分是其治疗周围血管病(静脉、动脉及淋巴系统疾病)的有效部位，主要包括香叶木苷(Diosmin)、木犀草苷(Luteoloside)、芸香苷(Rutin)等。据研究表明，蓬子菜治疗静脉系统疾病的活性成分主要为香叶木苷(Diosmin，3'，5，7-三羟基4'-甲氧基黄酮-7-芸香苷)，具有改善微循环和抗炎的作用［1］。本实验以香叶木苷药理作用和急性血瘀模型大鼠的病理表现为基础，通过测定凝血四项指标，证明香叶木苷具有抗凝血和改善纤溶系统功能的作用;同时，通过测定血液中相关细胞黏附因子的含量，证明香叶木苷具有改善血管内皮功能的作用，为蓬子菜治疗血瘀证的临床使用提供药效学依据。

1 材料

1.1 实验动物

Wistar雄性大鼠，体质量200～300g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心(合格证号:SCXK2009-0002)。

1.2 药品与试剂

香叶木苷(C28H32O15)，质量分数≥90%(HPLC);阿司匹林泡腾片(阿斯利康制药有限公司，批号H32026199);盐酸肾上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批号H12020526);水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20130325);大鼠sICAM-1 ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司，批号1406053);大鼠sVCAM-1 ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司，批号1406091);凝血酶原时间测定试剂盒(Siemens Lot545570);活化部分凝血活酶时间测定试剂盒(Siemens Lot538084);凝血酶时间测定试剂盒(Siemens Lot504472);纤维蛋白原测定试剂盒(Siemens Lot546743)。

1.3 仪器

全自动血液凝固仪(CA-7000，SYSMEX);离心机(KDC-160HR，安徽中科中佳科学仪器有限公司);连续光谱扫描式酶标仪(SpectraMax Plus384，Molecular Devices)。

2 方法

2.1 分组与给药

Wistar大鼠，雄性，平均体质量250g。随机分成6组，每组10只。大鼠给药剂量参考陈奇主编《药理试验方法学》，按人的临床给药剂量进行换算。实验分组如下:空白组与模型组:均灌胃与给药组等体积生理盐水;香叶木苷低剂量组:45mg/(kg·d);香叶木苷中剂量组:90mg/(kg·d);香叶木苷高剂量组:180mg/(kg·d);阿司匹林组:25mg/(kg·d)。各组均采用灌胃给药，按剂量连续给药14天。

2.2 造模方法

各组大鼠连续灌胃14天，于第13天给药后，除空白组外，各组大鼠采用皮下注射，每只大鼠每次注射盐酸肾上腺素0.8mg/kg，共2次，间隔4h。于第一次注射后2h时，将除空白组外其他组别的大鼠均置于0～2℃冰水中浸泡5min，制造大鼠急性血瘀模型。造模后，禁食不禁水。在禁食第12h后，于手术前30min时最后一次灌胃给药。

2.3 取材方法

采用腹腔注射麻醉，麻醉剂为10%水合氯醛。将大鼠仰卧位固定，沿腹中线剑突以下切开皮肤3cm，进行下腔静脉采血，并于4h内检测凝血功能指标。并将部分血液分别取血清、血浆分装，贮存于-80℃冰箱，以用于检测血液中细胞黏附因子的含量。

2.4 检测方法

2.4.1 凝血功能检测

将处理后的样本及各种所需试剂放入血液凝固仪，检测凝血四项。即PT(凝血酶原时间)、APTT(活化部分凝血活酶时间)、TT(凝血酶时间)、FIB(纤维蛋白原)。

2.4.2 细胞黏附因子sICAM-1、sVCAM-1检测

采用ELISA法，检测样本中sICAM-1(可溶性细胞间黏附因子-1)、sVCAM-1(可溶性血管细胞黏附因子-1)含量，所有操作严格按说明书进行。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 香叶木苷对急性血瘀模型大鼠凝血功能的影响

由表1可知，与空白组比较，模型组PT、APTT、TT时间缩短，FIB值升高，具有统计学意义(P＜0.01)。表明在造模过程中，血瘀大鼠的凝血功能明显发生异常。PT:与模型组相比，香叶木苷各剂量组的PT时间均有不同程度延长，其中低剂量组有统计学意义(P＜0.01)，中剂量组也有统计学意义(P＜0.05)，而高剂量组则无统计学意义。APTT:与模型组相比，香叶木苷各剂量组APTT时间均延长，其中低、高剂量组有统计学意义(P＜0.05)，而中剂量组也有统计学意义(P＜0.01)。TT:与模型组相比，香叶木苷各剂量组均能延长TT时间，其中低、中剂量组有统计学意义(P＜0.01)，高剂量组无统计学意义。FIB:与模型组相比，香叶木苷各剂量组FIB值降低，且均具有统计学意义(P＜0.01)。

蓬子菜中香叶木苷对急性血瘀模型大鼠PT时间的延长，表明香叶木苷能抑制外源性凝血途径;对APTT时间的延长，表明香叶木苷有抑制内源性凝血途径的作用;对FIB值的降低，表明香叶木苷能有效降低血浆纤维蛋白原含量，促进纤溶活性;对TT时间的延长，表明香叶木苷能延长纤维蛋白原转变为纤维蛋白的时间，减慢纤维蛋白形成速度，抑制血液凝固。

表1 香叶木苷对大鼠凝血功能的影响()

表1 香叶木苷对大鼠凝血功能的影响()

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;与空白组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05。

组别 剂量(mg/kg) PT(s) APTT(s) FIB(g/L) TT(s)空白组 - 10.82±0.21＊＊ 23.82±0.59＊＊ 2.96±0.02＊＊ 46.66±1.44＊＊模型组 - 9.62±0.35△△ 17.34±1.66△△ 4.79±0.07△△ 41.35±0.13△△低剂量组 45 11.23±0.71＊＊ 20.23±0.33* 3.78±0.09＊＊ 45.40±0.52＊＊中剂量组 90 11.75±1.35* 22.45±1.80＊＊ 3.84±0.42＊＊ 47.50±1.65＊＊高剂量组 180 9.89±0.27 19.31±0.83* 3.62±0.22＊＊ 42.00±1.55阿司匹林组 25 12.18±0.35＊＊ 19.26±1.79 4.11±0.16＊＊42.16±1.25

3.2 香叶木苷对细胞黏附因子sICAM-1、sVCAM-1的影响

由表2可知，与空白组相比，模型组所释放的sICAM-1和sVCAM-1含量增多，均具有统计学意义(P＜0.05)，表明在急性血瘀造模过程中，血管内皮受损，血液中黏附因子表达上调，导致内皮细胞黏附白细胞能力增强，引起炎症发生，促进血液高凝状态，导致血瘀发生。

sICAM-1:与模型组相比，香叶木苷各剂量组能明显降低sICAM-1的含量，其低剂量组较之模型组有统计学意义(P＜0.05)，中、高剂量组仍有统计学意义(P＜0.01)。

sVCAM-1:与模型组相比，香叶木苷各剂量组均可有效降低sVCAM-1的含量，且各组均具有统计学意义(P＜0.01)。

蓬子菜中香叶木苷能改善白细胞的流变性，抑制白细胞与血管内皮黏附，从而抑制炎症的发生，改善血瘀症状。

表2 香叶木苷对大鼠sICAM-1和sVCAM-1的影响()

表2 香叶木苷对大鼠sICAM-1和sVCAM-1的影响()

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;与空白组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05。

组别 剂量(mg/kg)sICAM-1(ng/ml)sVCAM-1(ng/ml)空白组 - 13.07±3.60* 49.00±34.41*模型组 - 17.34±4.41△ 90.37±39.32△低剂量组 45 10.23±6.28* 32.84±25.29＊＊中剂量组 90 9.39±5.89＊＊ 35.72±30.31＊＊高剂量组 180 10.25±5.24＊＊ 27.07±11.48＊＊阿司匹林组 25 11.16±6.84* 26.14±6.96＊＊

4 讨论

本实验所采用的血瘀造模方法，可导致健康动物处于急性应激状态，从而造成血管内皮受损，而内皮细胞的损伤正是血管病变的始因之一。相对的，血管内皮功能失调可进一步促发血瘀证。

血瘀证可由多种因素引起，并不同程度造成血管内皮损伤，引发血管内皮功能障碍，导致单核细胞、中性粒细胞与内皮细胞黏附，继而释放黏附因子ICAM-1、VCAM-1等，介导血管内皮与白细胞黏附得更加紧密和稳定，并逐渐改变内皮细胞骨架形态，引发并扩大血管局部炎症［2］。血管内皮功能异常导致黏附分子ICAM-1、VCAM-1等从内皮表面脱落，以可溶形式sICAM-1、sVCAM-1等存在于血液中，可作为血管内皮损伤的早期标志物。

当血管内皮细胞损伤后，暴露内膜下蛋白基层，激活血小板，而在活化的血小板膜上则暴露出FIB的结合位点，黏附血浆中游离的纤维蛋白原，以它为连接桥梁，导致血小板聚集［3］，促进凝血酶生成，加快凝血速度，并激活内外源凝血系统。

实验结果显示，香叶木苷可改善血管内皮功能。血管内皮损伤参与了血瘀证的发生与发展过程，是血瘀证产生的重要基础。内皮细胞受损后，刺激血小板释放凝血酶，导致大量的ICAM-1、VCAM-1释放，促使内皮细胞黏附白细胞的能力增强，故血液中sICAM-1和sVCAM-1的含量与内皮细胞受损程度呈正相关［4］。香叶木苷能减少急性血瘀大鼠血管内皮中的ICAM-1、VCAM-1的释放，进而下调血液中sICAM-1和sVCAM-1的表达。

实验结果表明，香叶木苷能明显改善急性血瘀大鼠的凝血功能。凝血四项已被广泛用于检查凝血机制异常。PT反映外源性凝血因子含量，APTT反映内源性凝血因子含量，香叶木苷能延长PT、APTT时间，通过抑制外源及内源凝血途径，抑制血瘀发展和血栓形成。TT反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白的时间，香叶木苷能延长TT时间，增强纤溶活力，降低凝血因子活性。FIB即凝血因子I，是一种主要的凝血蛋白质，香叶木苷能降低FIB含量，从而降低血液黏度，抑制血瘀的进一步发展。

［1］苏秀丽.香叶木苷调控血栓靶蛋白的研究［D］.哈尔滨:哈尔滨工业大学，2012.

［2］郭杨志.益气化痰活血法对AS黏附分子的影响及其与血脂异常证候的相关性［D］.北京:北京中医药大学，2014.

［3］陈可冀，薛梅，殷惠军.血小板活化与冠状动脉粥样硬化性心脏病和血瘀证的关系［J］.首都军医大学学报，2008，29(3):267-269.

［4］柴欣楼，张永生，等.葛根素对人脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-6及NO含量的影响［J］.北京中医药大学学报，2010，33(8):546-549.