STAT3基因siRNA表达载体的构建及鉴定

刘　洋，靳秋月，段美庆，樊淑珍，陈立军※

(1.内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特 010059； 2.武警后勤学院生物化学教研室，天津 300309)

STAT3基因siRNA表达载体的构建及鉴定

刘洋1，靳秋月2，段美庆1，樊淑珍1，陈立军2※

(1.内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特 010059； 2.武警后勤学院生物化学教研室，天津 300309)

摘要：目的利用RNA干扰技术，以信号转导和转录激活因子3(STAT3)为靶基因，设计构建重组体，并进行序列分析鉴定。方法设计一条有小发夹结构的DNA序列，聚合酶链反应(PCR)扩增合成siRNA表达框架(SECs)表达框架，克隆至载体psiLentGeneTM中构建重组体，转化E.coli DH5α菌株，提取质粒进行酶切鉴定后测序分析。结果重组质粒经EcoRⅤ酶切、电泳、测序分析表明插入序列正确，重组质粒构建成功。结论成功构建了STAT3靶向RNA干扰重组体，为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。

关键词：信号转导和转录激活因子3；RNA干扰；质粒

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是基因转录后沉默的一种重要机制，其是通过核酸酶切割双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA),将其变成21～25 nt的小干扰RNA(small minterfering RNA，siRNA)，通过siRNA介导识别，然后靶向切割同源性信使RNA分子而实现的[1-2]。RNAi技术是一种高效的特定基因表达调控的新技术，作为分子生物学研究的重要工具之一，被广泛用于功能基因组研究以及肿瘤基因治疗研究[3-7]。siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一段DNA序列，该序列可在哺乳动物细胞中表达siRNA，其由3部分组成，包括RNA聚合酶启动子、发夹式siRNA模板以及RNA聚合酶终止子，RNA聚合酶Ⅲ能够识别启动子，从而转录产生siRNA分子，进一步引发RNAi[8-10]。本实验成功构建了针对信号转导和转录激活因子3(signal transduction and activators of transcription，STAT3)的siRNA表达载体，这为沉默STAT3基因的表达及肿瘤的靶向治疗提供了基础，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料E.coli DH5α感受态细胞及质粒提取试剂盒均由北京天根公司提供；产物纯化试剂盒由美国PROMEGA公司提供；Marker由北京天根公司提供。Luria-Bertani(LB)液体及固体培养基自行配置。STAT3基因片段由上海赛百盛公司合成。

1.2方法

1.2.1设计STAT3特异性的siRNA通过查询Genebank，获取人的STAT3信使RNA全序列(序列号：NM003150)。根据干扰RNA设计原则，寻找到干扰RNA的靶序列。确认此靶向基因是唯一的、对于STAT3是特异的，且此部位无碱基多态性，同时不会抑制其他基因的表达。该序列经过BIast，搜寻EST基因库得到。1426～1444的核苷酸碱基序TTGAATTCTGCAGAGAGGC为RNA的干扰序列。按照天根公司的siLentGeneTMU6盒提供的干扰RNA引物设计原则，构建序列下游引物。该引物须包括：5′磷酸碱基、局部的EcoRⅤ序列、U6终止序列、回文茎环结构(由靶序列和袢环以及靶序列的反义互补组成)以及U6盒的配对序列，引物序列为5′-ATCTAAAAAGCCTCTCTGCAGAATTCAATCTCTTGAATTGAA-TTCTGCAGAGAGGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA -3′。

1.2.2SECs的体外合成用试剂盒扩增发夹结构，用siLentGeneTM聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) DNA纯化系统进行PCR产物纯化，最后用2%琼脂糖进行纯化产物凝胶分析。

1.2.3载体与siRNA模板的连接将前期纯化好的PCR产物与psiLentGeneTM载体建立连接体系，充分混匀，室温孵育1 h。同时设置空质粒对照。

1.2.4连接产物的转化重组质粒和空质粒用热激方法分别转入到感受态细胞大肠埃希菌DH5α中，将已转化的感受态细胞加到含氨苄西林抗生素的LB固体培养基，用无菌弯头玻棒均匀涂开细胞，把平板倒置，37 ℃培养12～16 h[11-12]。

1.2.5阳性重组克隆的筛选通过蓝白斑法，挑选白色菌落接种到含有氨苄西林的LB培养基中，在37 ℃温箱中振荡过夜培养，然后将培养的细菌菌液使用质粒小提试剂盒提取可能的菌落质粒[13]。

1.2.6重组质粒的鉴定重组质粒用EcoR Ⅴ限制性内切酶进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，酶切产物送大连宝生物工程有限公司进行测序分析。

2结果

2.1SECs的体外合成以发夹式siRNA模板寡聚核苷酸为模板合成SECs，2%琼脂糖凝胶电泳，SECs条带位置在300 bp左右(图1) 。

2.2重组质粒的酶切鉴定质粒psiLentGeneTM上含有EcoR Ⅴ的酶切位点，插入目的基因片段后，如若插入正确，则能被EcoRⅤ酶切出一条约为300 bp的小带和一条大小相似于原载体约4000 bp的条带。碱裂解法小量提取质粒，质粒DNA用EcoR Ⅴ酶切，酶切后的产物在1%琼脂糖凝胶电泳中得到了大小为4000 bp和300 bp的条带(图2)。

2.3测序结果由PCR合成的STAT3-siRNA表达盒，凝胶电泳显示合成片段的大小与实验设计相符，约为300 bp，经过测序分析证实STAT3-siRNA表达盒的序列与实验设计序列相符，共474 bp。序列由大连宝生物工程有限公司进行测序，由此来证实所得到的重组载体序列正确(图3)。

1、2、3、4：SECs；5：Marker

1：空质粒；2、3：EcoRⅤ酶切图；4:Marker

注：STAT3-siRNA表达盒序列测序结果与设计的约300 bp干扰序列完全一致

图3重组载体测序图

3讨论

STAT蛋白家族能够被不同的细胞因子受体激活，是细胞因子与受体相互作用的载体，其能保持信号在细胞内传递的特异性。在STAT蛋白家族中，异常活化的STAT3及其相关基因与许多恶性肿瘤关系密切[14]。研究表明，酪氨酸激酶信号转导途径的异常与一些疾病关系密切，STAT3的异常高表达和持续激活存在于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及多发性骨髓瘤等肿瘤细胞和组织中，其对于肿瘤细胞的形成、增殖、凋亡抑制等过程有重要作用[15-19]。

沉默STAT3基因可能会给肿瘤治疗带来新的方向，目前有多种方法可抑制基因的表达，但研究的焦点还是RNAi，尤其是siRNA[20-22]。许多研究表明，siRNA可高效阻断哺乳动物细胞中某些特定基因的表达[23-24]。与RNA正义和反义RNA基因干涉相比，siRNA的效果更强、持续时间更长，甚至可延续到下一代，其也不受注射部位的影响。

目前，siRNA的研究多采用体外转录法、PCR法、RNA合成法、质粒或病毒载体法等[25]。体外合成siRNA比较方便，其抑制效果也较好，容易实现，适合快速筛选所需要的序列，但不能用于长期介导RNAi，用于基因治疗时RNA会被RNase降解，因此无法满足动物和人体研究的要求。此外，还有一个重要问题，即RNAi衰减，对于低级生物，dsRNA或siRNA产生的RNAi能够稳定表达，并产生放大效应；但在较高级的哺乳动物和人类细胞内缺少RNAi的放大机制，在原代细胞中有时会对导入的dsRNA或siRNA产生拮抗，在转染阳性的细胞内这种现象在数天后会慢慢消失[25]。虽然siRNA表达载体需要克隆，且需要经过序列检测来证实，但这种方法容易大量扩增载体，且构建好的质粒可长期使用，是一种可以进行长期研究的方法。一般使用的siRNA表达载体是能够在哺乳动物细胞中有效表达的短发卡结构RNA，它是含有RNA聚合酶Ⅲ启动子的载体[26]，如人源H1启动子和人源或鼠源U6启动子，它们的区别仅是转录起始点的碱基稍有不同，这些启动子能够在哺乳动物细胞中由RNA聚合酶Ⅲ启动子操纵一段小的发夹siRNA表达干扰作用。U6启动子在细胞内表达丰富，其能够精确地起始和终止真核细胞内RNA的转录：限制性内切酶正好切断U6启动子的转录起始位置，能直接插入siRNA序列，转录后不需要切除额外碱基[27]。本研究设计时，在RNA聚合酶Ⅲ启动子与4～5个T(终止RNA的转录)之间插入一段反向重复的回文序列，两个反向重复序列间有一个环状结构，该结构最好是由9个碱基的间隔区来形成，从G或A开始转录，于转录终止位置的第2个碱基处终止，最后折叠成一个具有3′UU突出末端的茎环结构。在体内，Dicer将该结构切割成具有活性的siRNA分子，最终发挥RNAi作用。该表达载体具有以下优势：①操作过程比较简单，不用提取对实验条件要求苛刻的RNA；②能够长时间抑制目的基因的表达；③可以复制扩增载体(如质粒或病毒)[28]，与化学合成法相比，可显著降低制备siRNA的成本。该方法适用于研究需要用抗生素筛选才能表达siRNA的细胞和维持较长时间基因沉默的细胞，不适用于siRNA序列筛选。目前，质粒法已成为研究的热点。

该实验成功地构建了能够阻断STAT3基因表达的干扰RNA序列，并同时将该序列克隆到载体psiLentGeneTM中，其为今后的研究打下了坚实的基础，为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。

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The Building and Identification of siRNA STAT3 Gene Expression Vector

LIUYang1，JINQiu-yue2，DUANMei-qing1，FANShu-zheng1，CHENLi-jun2

(1.DepartmentofLaboratoryAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010059,China; 2.DepartmentofBiochemistry，LogisticsInstituteofPolice，Tianjin300309,China)

Abstract：ObjectiveThis study used RNA interference technology,selected STAT3 gene as the target,and then design and construction a recombinant vector and then identification the gene sequence analysis.MethodsDesign a DNA sequence with a small hairpin structure,PCR amplification a siRNA expression cassettes,cloning vector to construct recombinants in psiLentGeneTM into E.coli DH5α strain,extract plasmid after enzyme digestion sequencing.ResultsRecombinant plasmid by EcoR Ⅴ enzyme,electrophoresis and Sequencing analysis showed that the inserted sequence is correct,the recombinant plasmids were successfully constructed. ConclusionThe successful construction of STAT3 targeted RNA interference recombinant,provides some new methods for gene therapy of cancer research at the molecular level,cellular level and the overall level of.

Key words：Signal transduction and activators of transcription3; RNA interference; Plasmid

收稿日期：2014-04-15修回日期：2014-11-27编辑：辛欣

基金项目：武警医学院总部级科研项目(WKH2006-6)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.053

中图分类号：R735.35

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)04-0715-04