不同来源精子在ICSI中对受精、胚胎发育的影响

金　华，丁家怡，邵　骏

(南通市妇幼保健院生殖医学中心，江苏 南通 226000)

不同来源精子在ICSI中对受精、胚胎发育的影响

金华，丁家怡※，邵骏

(南通市妇幼保健院生殖医学中心，江苏 南通 226000)

摘要：目的探讨不同来源精子在卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术中对受精、胚胎发育的影响。方法选择2012年1月至2014年12月南通市妇幼保健院收治的180例因单纯男性因素行ICSI助孕治疗的患者为研究对象，按照患者受孕精子的不同来源分为射精组、睾丸穿刺取精术(TESA)组和经皮附睾穿刺取精术(PESA)组，各60例。比较三组患者受精率及胚胎发育情况。结果射精组、TESA组和PESA组患者的正常受精率分别为64.8%(467/721)、61.7%(441/715)和76.5%(555/726)，PESA组患者的正常受精率高于射精组和TESA组(P<0.05)，而三组患者的卵裂率、优质胚胎率、妊娠率以及胚胎种植率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论不同来源的精子对ICSI中受精率影响不同，但对胚胎发育质量无显著影响，其中，PESA来源的精子正常受精率较高，胚胎发育良好，可作为梗阻性无精症临床治疗的有效方法。

关键词：卵胞浆内单精子注射；睾丸穿刺取精；经皮附睾穿刺取精术；受精；胚胎发育

不育不孕症是生殖医学常见病之一，据统计其发病率在育龄夫妇中占8%～10%，且呈不断升高趋势，其中男性因素占30%～50%[1-2]。男方因素主要包括无精子症、精子数量和质量异常、性功能障碍及射精障碍等，对于无精子症和重度少弱畸精子症患者，治疗的唯一方案就是供精。卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术自1992年报道以来成为男性不育治疗的重要手段，已成为目前治疗无精子症和精液异常的最有效方法[3-4]。ICSI避开了常规受精过程中精子获能、顶体反应、识别、黏附、融合等步骤，经显微操作将精子直接注入到卵细胞胞质内完成体外受精，降低了常规辅助受精对精子质量和数量的要求，极大提高了受孕的可能性。研究人员采用睾丸穿刺取精(testicular sperm retrieval puncture,TESA)和经皮附睾穿刺取精术(percutaneous epididymal sperm retrieval,PESA)获取患者精子并结合ICSI在治疗梗阻性或非梗阻性无精子不育症中获得巨大成功[5]。但是，国内外研究人员对不同来源的精子在ICSI中受精率、卵裂率、胚胎发育情况及妊娠结局报道不一，争议较大[6-7]。本研究主要探讨不同来源精子在ICSI中对受精、胚胎发育的影响，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选择2012年1月至2014年12月南通市妇幼保健院收治的180例因单纯男性因素行ICSI助孕治疗的患者为研究对象，患者均符合世界卫生组织精子实验室诊断和处理手册第5版诊断标准[8]中的男性不育因素。按照患者受孕精子的不同来源分为射精组、TESA组和PESA组，各60例。其中，TESA组为梗阻性无精子患者和非梗阻性无精子症患者，PESA组为梗阻性无精子患者。

1.2纳入标准 ①女性年龄<40岁，不孕年限≤15年，基础激素水平在正常范围，月经周期规律，并排除子宫肌瘤、子宫内膜异位等症；②单纯男性因素(梗阻性无精症、隐匿性无精症、严重少弱畸精症)，染色体核型正常；③均为第一次促性腺激素释放激素激动剂长方案控制性卵巢刺激周期。

1.3控制性刺激排卵方案采取黄体中期性腺激素释放激素拮抗剂长方案进行控制下卵巢刺激周期，降调超过14 d时对女方激素水平、窦状卵泡直径及子宫内膜厚度进行测定，待卵泡刺激素<5 U/L、促黄体生成素≤5 U/L、雌二醇≤50 μg/L、窦状卵泡直径<8 mm、内膜厚度≤5 mm后应用促性腺激素150～300 U启动控制下卵巢刺激周期，并对患者血清雌二醇和促黄体生成素水平及卵泡情况进行检测，根据检测结果合理调整促卵泡激素用量。当直径达到18 mm的主导卵泡超过3个时肌内注射4000～10 000 U人绒毛膜促性腺激素(北京泰格科信生物科技有限公司生产，批号：20111024)，36 h后经B超引导取出卵细胞。

1.4精子的获取及处理方法射精组：取精前，患者禁欲 3～7 d，采取手淫方式留取精液标本，利用密度梯度离心法对精液进行处理，备检。TESA组：患者仰卧，对阴囊部位进行常规消毒，选择穿刺点，在使用2%利多卡因局部麻醉后采用含有2 mL精子培养液(SAGE,USA)的5 mL注射器行睾丸穿刺取精，负压下抽取出睾丸组织，体视镜下将曲精细管切碎，混匀后常规离心沉淀，备检。PESA组：患者仰卧，对阴囊部位进行常规消毒，选择穿刺点，在使用2%利多卡因局部麻醉后采用含有1 mL精子培养液(SAGE,USA)的5 mL注射器行经皮附睾穿刺取精，抽取淡黄色附睾液，混匀后离心沉淀，备检。

1.5ICSI治疗在取卵2～4 h后将卵丘颗粒细胞除去，选择M2期卵细胞和形态正常、活力较好的精子进行ICSI治疗。对胚胎发育进行动态观察并在取卵后第3日根据胚胎发育速度、卵裂球大小形状、无核碎片量及分布等情况进行评级，分为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4共7个级别，其中1～2级为优质胚胎，1～3级为可移植胚胎。

取卵后第3日行胚胎移植，给予地屈孕酮片、黄体酮等黄体支持，胚胎移植半个月左右对患者尿人绒毛膜促性腺激素进行检测，阳性患者为生化妊娠。移植后35 d对患者进行B超检查，发现孕囊及胚芽者为临床妊娠。

1.6观察项目

1.6.1受精、卵裂及胚胎质量观察卵子在ICSI后16～18 h观察有无原核形成，正常受精为双原核(2PN)；在受精后第3日观察胚胎卵裂情况，记录卵裂球数目；根据卵裂球的均匀程度、大小及无核碎片的量对胚胎质量进行评价，根据 Peter 卵裂期胚胎评分标准[9]，胚胎培养3 d后细胞数为7～8个，核碎片评级为Ⅰ～Ⅱ级的胚胎为优质胚胎。

1.6.2胚胎移植及妊娠的观察取第3日的胚胎进行新鲜周期胚胎移植，14 d后检测女方血人绒毛膜促性腺激素水平，观察是否受孕；30 d后超声检查观察女方宫腔内是否存在孕囊，并结合心管脉搏确定女方是否妊娠。

2结果

2.1三组患者一般资料比较3组患者的年龄、不孕年限、基础卵泡刺激素及人绒毛膜促性腺激素日雌二醇值比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2三组患者受精及胚胎发育情况比较射精组、TESA组和PESA组的正常受精率比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中PESA组患者的正常受精率高于射精组和TESA组(χ2=23.769，36.807，P<0.05)；三组患者的卵裂率、优质胚胎率、妊娠率以及胚胎种植率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1　三组因单纯男性因素行卵胞浆内单精子注射助孕治疗患者的一般资料比较　±s)

TESA:睾丸穿刺取精术；PESA；经皮附睾穿刺取精术

表2　三组因单纯男性因素行卵胞浆内单精子注射助孕治疗患者的受精及胚胎发育情况比较　(n=60,%)

TESA:睾丸穿刺取精术；PESA；经皮附睾穿刺取精术；a与PESA组比较，P<0.05

3讨论

ICSI是将单个精子在体外直接注入卵母细胞胞质内使精子与卵细胞结合形成受精卵，从而有效治疗部分不孕不育疾病，特别是男性不育患者，如梗阻性无精症、重度少弱畸精子症等，临床疗效显著[10]。ICSI不仅能采用密度低、活力差的射出精子，还能采用附睾、睾丸中的精子及经冷冻复苏后的精子，均能使卵母细胞受精并最终发育成胚胎[11]。ICSI用于治疗男方因素导致的不孕不育已获得很大成功，该技术可以利用射出的精子、睾丸中的精子及附睾中的精子使成熟卵母细胞正常受精并形成优质胚胎，获得临床妊娠及分娩，但是不同来源的精子对于ICSI过程中卵母细胞的受精及胚胎的发育影响目前临床报道尚不一致。首先，可以肯定的是精子的质量会严重影响卵母细胞体外受精率，不同来源的精子由于其形态、成熟度及质量上的差异会影响其与卵母细胞的结合，从而影响受精。研究表明[12]，来源于附睾的精子行ICSI治疗后正常受精率明显高于睾丸的精子，说明受精率与精子成熟度有关，睾丸中的精子生成后在附睾内经过精核的成熟、精子质膜的通透性改变和顶体外膜抗原分布的改变等进一步成熟后具有更强的运动能力和受精能力，更加有利于与卵母细胞结合而受精。本研究中，射精组、TESA组和PESA组患者的正常受精率分别为64.8%、61.7%和76.5%，PESA组患者的正常受精率高于射精组和TESA组(P<0.05)。PESA组患者的正常受精率较射精组高的原因是射精组隐匿性精子症和严重少弱畸精子症多由于睾丸生精功能障碍或低下导致精子数量较少，畸形率较高，而PESA组患者仅包括梗阻性精子症患者，这些患者生精功能正常，精子数量较高，不影响受精过程。

卵细胞受精后的卵裂率及优质胚胎率是反映胚胎质量的重要指标，从4～8细胞阶段受精卵mRNA即开始转录，父方

基因开始表达，本身存在缺陷的精子对于父方基因的表达将产生影响，导致4～8细胞阶段的胚胎发育缓滞。一般情况下，受精后第3日的胚胎处于6～8细胞期或早期致密化，因此，受精后第3日卵裂数为7～8个的Ⅰ、Ⅱ级胚胎属于优质胚胎，发育潜能较好。

胚胎种植率及妊娠率是反映移植胚胎在体内发育潜能的重要指标，有研究称，精子的来源对ICSI治疗的胚胎种植率及妊娠率无明显影响[13]。本研究中，不同来源精子受精后得到的胚胎的卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率以及妊娠率比较差异无统计学意义，其原因可能是受精完成后，胚胎的发育与精子无关[14]。

综上所述，ICSI治疗可应用不同来源的精子，不同来源的精子对ICSI中受精率影响不同，PESA来源的精子正常受精率较高。同时，不同来源的精子对于胚胎的发育，包括卵母细胞受精后的卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率及妊娠率均无显著影响。因此，PESA联合ICSI对于梗阻性无精子症、不射精症、死精子症、输精管缺失以及性功能障碍等男性因素导致不育症的治疗，可获得较高的受精率和妊娠率，促进胚胎的健康发育具有重要意义。

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The Comparative Study of Effect of Spermatozoa from Different Sources on Normal Fertilization and Embryo Development in Intracytoplasmic Sperm Injection Cycles

JINHua，DINGJia-yi,SHAOJun.

(DepartmentofCenterforReproductiveMedicine,NantongCityMaternalandChildHealthHospital,Nantong226000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate effect of spermatozoa from different sources on normal fertilization and embryo development in intracytoplasmic sperm injection(ICSI) cycles.MethodsA total of 180 cases of male factor alone for ICSI progesterone therapy in Nantong City Maternal and Child Health Hospital from Jan.2012 to Dec.2014 selected for the study were divided into ejaculated spermatozoa group,testicular sperm aspiration(TESA) group and percutaneous epididymal sperm aspiration(PESA) group according to different sources,each of 60 cases.Fertilization rate and embryo development of the three groups were compared.ResultsThe normal fertilization rate of ejaculated spermatozoa group,TESA group and PESA group were 64.8%(467/721)，61.7%(441/715) and 76.5%(555/726),and the normal fertilization rate of PESA group was significantly higher the other two groups(P<0.05).The cleavage rate,high-quality embryo rate,pregnancy rate and implantation rate had no statistically significant difference(P>0.05).ConclusionThe normal fertilization rate of spermatozoa from different sources are diffreent,but the quality of the embryo has no significant effect,and the spermatozoa obtained by PESA has a higher rate of normal fertilization and high-quality embryo,which is an effective clinical treatment method for obstructive azoospermia.

Key words:Intracytoplasmic sperm injection; Testicular sperm aspiration; Percutaneous epididymal sperm aspiration; Fertilization; Embryo development

收稿日期：2015-06-24修回日期：2015-08-17编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.063

中图分类号：R714

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)23-4392-03