全血及血清中羟氯喹HPLC测定方法的建立及其应用

罗雪梅，司慧敏，姚 瑶，葛卫红*

南京大学医学院附属鼓楼医院1药学部，2风湿免疫科，南京 210008

全血及血清中羟氯喹HPLC测定方法的建立及其应用

罗雪梅1，司慧敏2，姚 瑶1，葛卫红1*

南京大学医学院附属鼓楼医院1药学部，2风湿免疫科，南京 210008

目的：建立高效液相色谱法测定人全血及血清中羟氯喹浓度。方法：200 μL人全血（血清）样品经400 μL的10%甲酸-乙腈（1∶9）沉淀后，取上清液进行色谱分析。采用Zorbax SBC18为色谱柱，以乙腈-0.2 mol·L-1磷酸二氢钾（15∶85，v/v，磷酸调pH=3.0）为流动相，检测波长：254 nm，流速：0.8 mL·min-1，进样量：30 μL。结果：对46例长期（＞1年）服用硫酸羟氯喹（200 mg· d-1）的系统性红斑狼疮患者的血药谷浓度进行检测分析。羟氯喹在10～3000 ng·mL-1线性关系良好，批内、批间精密度RSD均小于8.6%，全血及血清样品的提取回收率分别为74.5%～78.6%和80.7%～85.4%。患者平均全血/血清谷浓度分别为（707.6±398.4）ng·mL-1、（282.2±153.8）ng·mL-1。结论：本法操作简便，灵敏，准确度高，适用于羟氯喹血药浓度检测及药效学研究。

羟氯喹；高效液相色谱法；血清；全血；系统性红斑狼疮

羟氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）是4-氨基喹诺酮类的抗疟药，对慢性类风湿关节炎及系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等疾病疗效确切[1]。虽然长期服用羟氯喹有可能会引发一些眼科疾病[2]，但相对其治疗优势，羟氯喹仍然在SLE治疗中占有重要地位。

羟氯喹半衰期长，可长期用药，但个体差异较大[3-4]，关于羟氯喹浓度与药效关系的研究仍然存在众多争议[5-6]。由于口服羟氯喹后，药物迅速在眼、肾、肝、肺等器官分布。全血中浓度高于血清浓度，因血清浓度常受取血时间及离心时长影响而改变[7-9]，在过往研究中多以全血为研究对象。本试验所建立的HPLC-DAD法检测羟氯喹，易于普及，操作更为简单，且通过优化的色谱条件与前处理方法，可同时对全血及血清中羟氯喹的浓度进行检测，能满足临床对羟氯喹血药浓度控制的需求。

1 仪器与试药、试剂

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪 （含G1322A脱气阀，G1312A泵，G1367B进样器，G1330B柱温箱，G1316A紫外检测器）。

硫酸羟氯喹对照品 （批号100582-200401）、内标对乙酰氨基酚对照品（批号100018-200408）均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2 mol·L-1磷酸二氢钾（15∶85，v/v，磷酸调pH=3.0）；检测波长：254 nm；柱温：35℃；流量：0.8 mL·min-1；进样体积：30 μL。

2.2 全血及血清样品处理

全血样品：反复振摇混匀后取全血样品200 μL置于1.5 mL离心管中，加10%甲酸-乙腈 （1∶9）400 μL，振荡涡旋3次，每次15 s，14000 r·min-1离心6 min，取上清液30 μL进样分析。

血清样品：取血清样品200 μL，参照全血样品处理方法操作，进行HPLC法分析。

2.3 专属性试验

在 “2.1”色谱条件下羟氯喹保留时间为5.69 min，内标对乙酰氨基酚保留时间为6.82 min，两者峰形良好，其杂质峰对样品测定均无干扰（见图1）。

2.4 线性关系考察

精密称取硫酸羟氯喹13.01 mg（相当于羟氯喹10.13 mg），置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.013 mg·mL-1的羟氯喹储备液。分别在6份200 μL空白血清中，加入一定量的标准储备液，配成含羟氯喹浓度分别为10、30、100、300、1000、3000 ng·mL-1的标准含药血清。按“2.2”项下方法操作，同时制备空白样品，进行HPLC法分析，制备标准曲线。计算羟氯喹峰面积As和内标峰面积Ai的比值f（f=As/Ai），以峰面积比值f对血药浓度C（ng·mL-1）作权重回归，得羟氯喹回归方程：血清：f1=1.404×10-3C+1.214×10-3（r=0.9991）；全血：f2=2.280×10-3C-1.705×10-2（r=0.9988）；权重系数w=1/C2。结果显示，羟氯喹血清及全血浓度在10～3000 ng·mL-1线性关系均良好，最低定量限为10 ng·mL-1，信噪比大于10。

图1 羟氯喹及内标对乙酰氨基酚液相色谱图

2.5 精密度和准确度试验

制备含羟氯喹浓度分别为25、250、2500 ng· mL-1的标准含药血样，每个浓度各配制5份样品，计算批内精密度（日内RSD）；连续测定3个分析批样品，每批作随行标准曲线，计算日间精密度（日间RSD）；以加样回收率作为准确度。结果见表1。

2.6 提取回收率试验

配制并处理含羟氯喹浓度为25、250、2500 ng· mL-1的标准含药血样，每个浓度5份，作为回收率样品；另取5份不同来源的空白全血、血清，同法处理，取沉淀后上清液，加入羟氯喹和内标标准溶液，配制同上述3个质量浓度的标准含药血样，每个浓度平行5份，作为测定回收率的对照样品。将上述样品进样，记录色谱图，回收率样品峰面积与相应对照品峰面积均值之比即为提取回收率。测得全血、血清中内标对乙酰氨基酚的提取回收率分别为（98.3±2.2）%和（65.7±2.4）%，全血及血清中羟氯喹提取回收率符合生物样品分析要求，结果见表1。

表1 全血及血清中羟氯喹的精密度、准确度和回收率（n=5）

2.7 稳定性试验

制备含羟氯喹浓度分别为 25、250、2500 ng· mL-1的标准含药全血、血清数份，其中3份按“2.2”项下操作处理后，立即进样测定并放入进样器中，分别于室温下放置6 h、反复冻融及冷冻放置3周条件下测定其稳定性，同时考察待测样品溶液在进样器中的稳定性。结果见表2。羟氯喹全血及血清样品稳定性均较好。

表2 HPLC法测定全血及血清中羟氯喹的稳定性试验（n=3）

2.8 血药浓度的测定

将本法用于本院风湿免疫科46例口服硫酸羟氯喹片的系统性红斑狼疮患者的血药浓度检测。每位患者的持续服药时间超过1年，服药剂量为200 mg· d-1。谷浓度标本为当天患者服药前抽取[4]。患者平均全血和血清谷浓度分别为 （707.6±398.4）ng·mL-1、（282.2±153.8）ng·mL-1，全血及血清中药物浓度差异均较大，两者浓度比值为40.9%（19.8%～77.5%）。

3 结 论

本实验中采取了2倍体积的甲酸-乙腈（1∶9）沉淀的方式，在提高沉淀效率的同时并不延长处理时间，每个样品从前处理到分析，总时长控制在10 min以内。此前处理方法最低检测限可达10 ng·mL-1。为了防止Tett等[7]提出的离心时长对羟氯喹血清药物浓度可能造成的影响，本实验在前处理过程中对每一步离心的时长做了考察，结果发现，当全血离心制备血清样品时，若离心时长为1～5 min，最终测定浓度确实会因离心时间增加而提高，提示必须充分离心，使细胞内外达到一定平衡时，所测血清浓度较为恒定、准确。因此最终选择离心时长为8 min。

从测得的患者羟氯喹全血及血清谷浓度结果看出，长期服用相同剂量羟氯喹（200 mg·d-1）的SLE患者，个体血药浓度差异较大，这与文献报道结果相同[3]。引起浓度差异较大的原因：（1）可能与羟氯喹在体内受多种肝细胞色素P450酶CYP2D6、2C8、3A4/5代谢相关，不同个体代谢酶的差异会使血中羟氯喹浓度不同。（2）大部分缓解病情抗风湿药（DMRADs）如甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、羟氯喹均是ABCG2[多药耐药机制相关的药物排出泵（MDR）——三磷酸腺苷结合转运蛋白（ABC）G超家族成员2，MDR-ABC转运体中的一种]的底物，患者体内转运体的活性差异也是造成羟氯喹血药浓度个体差异较大的原因。

[1] Tang C,Godfrey T,Stawell R,et al.Hydroxychloro quine in lupus:emerging evidence supporting multiple beneficial effects[J].Intern Med J,2012,42(9):968-78.

[2] Wolfe F,Marmor MF.Rates and predictors of hydroxy chloroquine retinal toxicity in patients with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Care Res(Hoboken),2010,62(6):775-84.

[3] Furst DE.Pharmacokinetics of hydroxychloroquine and chloroquine during treatment of rheumatic diseases[J]. Lupus,1996,5(S1):S11-5.

[4] Costedoat-Chalumeau N,Amoura Z,Hulot JS,et al. Low blood concentration ofhydroxychloroquine isa marker for and predictor of disease exacerbations in patients with systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,2006,54(10):3284-90.

[5] Miller DR,Fiechtner JJ,Carpenter JR,et al.Plasma hydroxychloroquine concentrations and efficacy in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,1987,30(5):567-71.

[6] Costedoat-Chalumeau N,Galicier L,Auma觘tre O,Hydroxychloroquine in systemic lupus erythematosus:results of a French multicentre controlled trial(PLUS Study)[J].Ann Rheum Dis,2013,72(11):1786-92.

[7] Tett SE,Cutler DJ,Day RO,et al.A dose-ranging study of the pharmacokinetics of hydroxy-chloroquine following intravenous administration to healthy volunteers[J].Br J Clin Pharmacol,1988,26(3):303-13.

An HPLC Method for the Determination of Hydroxychloroquine in Both Serum and Blood Samples and Its Application in SLE Patients

LUO Xue-mei1,SI Hui-min2,YAO Yao1,GE Wei-hong1*
1Department of Medication;2Department of Rheumatology,the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China

Objective:In this study,a rapid and precise HPLC method for the determination of hydroxychloroquine in human blood and serum samples has been developed for further study.Methods:After simple deproteinization with two-fold volume of formic acid-acetonitrile(1∶9)the supernatants of the samples were assessed by HPLC.Chromatographic separation was performed on a Zorbax SB-C18column using the mobile phase of acetonitrile-0.2 mol·L-1KH2PO4(15∶85,v/v,pH was adjusted by H3PO4to 3)at a flow rate of 0.8 min·L-1,and the detection wavelength was 254 nm.The method was applied in the determination of hydroxychloroquine in blood/serum samples from 46 patients with systemic lupus erythematosus (SLE)after oral administration of 200 mg·d-1sulfate hydroxychloroquine for more than 1 year.Results:The calibration curves were linear over the range of 10-3000 ng·mL-1.The RSD of intra-day and inter-day precision and accuracy for hydroxychloroquine were within 8.6%.The average recoveries of hydroxychloroquine in blood and serum were 74.5%-78.6%and 80.7%-85.4%,respectively.The average trough blood and serum concentrations of hydroxychloroquine were(707.6±398.4)ng·mL-1and(282.2±153.8)ng·mL-1,respectively.Conclusion:The method can be used as an effective approach in clinic and research fields.

Hydroxychloroquine;HPLC;Serum;Blood;Systemic lupus erythematosus(SLE)

R969.1

A

1673-7806（2015）06-562-03

罗雪梅，女，药师 E-mail:yixuejiai@sina.com

*通讯作者葛卫红，女，主任药师，硕士生导师E-mail:6221230@sina.com

2015-02-13

2015-02-26