地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠模型肺组织IL-4R mRNA表达的影响

张 丽，白茹芹南京市胸科医院药剂科，南京 009；江苏省中医院药剂科，南京 009

地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠模型肺组织IL-4R mRNA表达的影响

张 丽1，白茹芹2*
1南京市胸科医院药剂科，南京 210029；2江苏省中医院药剂科，南京 210029

目的：研究地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠模型肺组织IL-4R mRNA表达的影响。方法：用卵蛋白制备过敏性哮喘豚鼠模型，观察地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠肺组织病理及IL-4R mRNA表达水平的影响。结果：地氯雷他定能显著改善过敏性哮喘豚鼠肺组织病理变化，明显降低肺组织IL-4R mRNA表达水平。结论：降低肺组织IL-4R mRNA的表达可能是地氯雷他定防治哮喘的基因机制。

地氯雷他定；过敏性哮喘；豚鼠；病理；IL-4受体

哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。地氯雷他定是氯雷他定在体内的活性代谢产物，属于第三代抗组胺药，研究证实地氯雷他定能抑制肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞释放细胞因子[2]。本课题组前期研究表明，地氯雷他定能显著延长过敏性哮喘豚鼠模型哮喘潜伏期，明显降低哮喘模型豚鼠肺泡灌洗液IL-4和IL-13水平，起到延缓哮喘发作的作用[3]。本研究以地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠模型肺组织病理及IL-4受体（IL-4R）表达的影响，从基因水平探讨地氯雷他定防治哮喘的机制。

1 材 料

1.1 药品与试剂

地氯雷他定（批号：14STBA001，上海先灵葆雅制药有限公司）；卵蛋白（武汉生命技术有限公司进口分装，Sigma）；地塞米松片（天津天药药业股份有限公司）；RNA抽提试剂TRIzol、实时定量PCR扩增预混溶液SYBR Green mix（日本Takara公司）；反转录试剂盒（美国ABI公司）；引物合成（上海生工公司）。

1.2 仪器

S-888F型超声雾化器（中外合资南京道芬电子有限分司）；Nanodrop 2000核酸定量仪（美国Thermofish公司）；StepOnePlusTM实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 动物

豚鼠，60只，体重160～180 g，雌雄各半，由南京江宁青龙山动物繁殖场提供。实验动物生产许可证：SCXK（苏）2012-0013。

2 方 法

2.1 过敏性哮喘豚鼠模型的制备

取豚鼠52只，按文献方法造模[4]。每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理盐水溶液1 mL，2周后进行引喘，取20 mL的1%卵蛋白生理盐水注入超声雾化器，将豚鼠放入雾化箱内，开动雾化器，当豚鼠出现喘促、咳嗽等呼吸道痉挛梗阻症状时，表示过敏性哮喘豚鼠造模成功。取出豚鼠，记录哮喘潜伏期，即雾化开始至豚鼠出现喘促、咳嗽的时间，若潜伏期超过4 min则示造模不成功。

2.2 分组给药

取造模成功的豚鼠32只，随机分为4组，每组8只，分别为（1）模型对照组：生理盐水5 mL·kg-1；（2）地氯雷他定Ⅰ组：0.1 mg·kg-1；（3）地氯雷他定Ⅱ组：0.3 mg·kg-1；（3）地塞米松组：0.1 mg·kg-1。每组豚鼠灌胃给药，每日1次，连续5 d。末次给药后1 h，按“2.1”法对豚鼠进行引喘。另取8只正常豚鼠做空白对照。

2.3 肺组织病理切片

完成上述实验[3]左肺灌洗后，取豚鼠右肺，切取部分肺组织，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肺组织病理状况。

2.4 组织mRNA提取、反转录及qRT-PCR

另取部分肺组织置研钵中，液氮预冷，待组织冷冻后使用研磨器充分研磨，TRIzol法提取组织总RNA，以Nanodrop微量分光光度计检测RNA浓度及纯度。反转录试剂盒将1 μg RNA反转录合成cDNA，然后在StepOnePlusTM实时定量PCR仪上进行检测。反应体系包含10 μL SYBR Green mix，3 μL cDNA模板，0.8 μL上下游引物，5.4 μL去离子水。IL-4R上游引物为5'-CTTACCGCAGCTTCAGCGAC-3'，下游引物为5'-CACAGTGGTTGGCTCAGAGA-3'。GAPDH为内参基因，上游引物为5'-CATTGTATCCGTTGTGGATCTGACATGC-3'，下游引物为5'-CCCTGTTGCTGTAGCCATATTTGT-3'。扩增条件为：95℃预变性5 min，接着94℃变性30 s，57℃退火30 s，72°C延伸1 min，扩增35个循环。采用ΔΔCt法分析数据，结果用2ΔΔCt表示。

2.5 统计学处理

3 结 果

3.1 各组豚鼠肺组织病理形态学观察

空白对照组豚鼠肺组织支气管和肺泡结构清晰，基本无炎症细胞浸润；模型对照组豚鼠支气管壁、肺间质及肺泡腔内可见以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主的大量炎症细胞浸润；地氯雷他定Ⅰ组豚鼠炎症细胞浸润明显少于模型对照组；地氯雷他定Ⅱ组和地塞米松组豚鼠支气管壁、肺间质及肺泡腔内偶见嗜酸性粒细胞浸润，并可见少量淋巴细胞浸润。HE染色观察豚鼠肺组织病理学改变见图1。

图1 HE染色观察豚鼠肺组织病理学改变（×200）

3.2 地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠模型肺组织IL-4R mRNA表达的影响

实验结果显示，模型对照组与正常对照组比较豚鼠肺组织IL-4R mRNA表达水平显著升高 （P＜0.01），而给予药物后肺组织IL-4R mRNA表达水平与模型对照组比较显著降低（P＜0.05，P＜0.01），用药组组间比较无差异（P＞0.05）。结果见图2。

4 讨 论

图2 地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠模型肺组织IL-4R mRNA表达的影响（±s，n=8）

Th2细胞分泌的多种细胞因子，如白介素4（IL-4）、IL-5和IL-13等，在哮喘发病过程中具有重要作用[5]。IL-4能使嗜酸性粒细胞数目增多，使炎性反应、气道高反应性增强[6]。IL-13可刺激B细胞的增殖和IgE的合成，后者通过与肥大细胞、嗜碱粒细胞的作用而诱发哮喘的急性发作[7]。IL-4和IL-13的生物活性都是通过与细胞表面相应受体IL-4R或IL-13R结合，继而激活细胞内多种非受体型蛋白质酪氨酸激酶而完成的[8]。IL-4R的α亚基为IL-13受体的组件之一，因此IL-4和IL-13均可与IL-4R结合发挥生物学效应[9]。本研究显示，过敏性哮喘豚鼠模型肺组织IL-4R mRNA表达明显增强，这与以往文献研究结果一致[10]。目前，口服抗过敏药物已成为治疗轻中度过敏性哮喘的推荐用药[11]。本实验中，给予地氯雷他定后，过敏性哮喘豚鼠模型的肺组织病理变化明显改善，肺组织IL-4R mRNA表达较模型组明显降低，这可能是地氯雷他定防治哮喘的基因机制。

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Effects of Desloratadine on the Expression of IL-4 Receptor mRNA in Lung Tissues of Allergic Asthma Guinea Pig

ZHANG Li1,BAI Ru-qin2*
1Depatment of Pharmacy,Nanjing Chest Hospital,Nanjing 210029;2DepartmentofPharmacy,Jiangsu Province Hospital of TCM,Nanjing 210009

Objective:To study the effects of desloratadine on the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues of allergic asthma guinea pig.Methods:The allergic asthma model of guinea pig was induced by ovalbumin.Then the effects of desloratadine were observed on the pathological changes and the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues.Results:Desloratadine could improve the pathological changes and decrease the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues.Conclusion:Decreasing the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues may be the mechanism of desloratadine in treating asthma.

Desloratadine;Allergic asthma;Guinea pig;Pathology;IL-4 receptor

R965.1

A

1673-7806（2015）06-552-03

张丽，女，主管药师 E-mail:njchzli@tom.com

*通讯作者白茹芹，女，副主任药师 E-mail:1537084738@qq.com

2015-05-27

2015-07-20