一个遗传性非综合征型耳聋家系的GJB2基因突变分析＊

王义旺，胡祥上，全庆丽，姜海鸥△

（1.湖南医药学院附属医院／怀化市第一人民医院耳鼻喉科，湖南怀化418000；2.湖南医药学院医学遗传学教研室，湖南怀化418000）

耳聋是最常见的感觉障碍性疾病之一，在新生儿中发病率约为1／1 000。按表型特征不同，遗传性耳聋可分为综合征型耳聋（syndromic hearing loss，SHL）和非综合征型耳聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL）［1］。NSHL可表现为多种遗传方式，包括常染色体显性遗传，常染色体隐性遗传，X 连锁遗传，Y 连锁遗传和线粒体遗传等。遗传性耳聋具有高度的遗传异质性。迄今为止，共定位NSHL 基因位点136个，已克隆的致病基因有60余个，其中导致遗传性NSHL的基因中，GJB2、SLC26A4、MYO15A、OTOF、CDH23和TMC1等基因突变较为常见，其中又以GJB2 基因突变最为常见［2］，在我国约18.31%的耳聋患者是由GJB2 基因突变导致的［3］。鉴此，作者对1个遗传性NSHL 家系成员的GJB2基因编码序列进行分析，旨在寻找耳聋患者的致病基因突变。

1 资料与方法

1.1 一般资料 该家系4代共14人，其中耳聋患者4例（图1）。先证者（Ⅲ2），男，42岁，12岁起双侧耳鸣并进行性听力减退，36岁发展为全聋。纯音测听显示左耳听力为85分贝，右耳听力为80分贝，属于重度耳聋。除耳聋之外，不伴其他器官系统的异常。该家系耳聋患者的起病年龄为12～25 岁，其他患者与先证者临床症状相似。临床表现为双侧耳鸣，听力减退为双耳对称性、以高频听力下降为主的感觉神经性耳聋。耳部CT 扫描、前庭功能及全身体格检查，均未发现异常。

图1 患者家系图

表1 PCR 扩增GJB2基因的引物

1.2 方法

1.2.1 DNA 制备 在获得知情同意之后，采集该家系9个成员的外周血样本，包括3例患者（Ⅱ2、Ⅱ5、Ⅲ2）和6名健康人（Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ6、Ⅲ1、Ⅲ5、Ⅳ1）。血液基因组DNA 提取试剂盒购自北京天根生化公司（批号DP318），按产品说明书介绍的方法提取基因组DNA。DNA 浓度测定后稀释成为25ng／μL 工作液。

1.2.2 PCR 扩增应用Primer5软件设计并合成3对引物（表1），扩增区域覆盖GJB2基因的两个外显子及外显子与内含子交界区域。PCR 反应体系：总体积为15μL，2×GC buffer 7.50μL（含MgCl210 mmol／L），dNTP 混合液（10 mmol／L）0.75μL，正反向引物（10μmol／L）各0.75μL，模板基因 组DNA 0.03μg，rTaq DNA 聚合酶（5U／μL）0.80μL，双蒸水补至15.00μL。反应条件：95 ℃预变性10min、95 ℃变性30s、55～60℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，72℃再延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶，恒压140V 电泳25min，溴化乙锭／紫外线观察，以证实PCR 扩增的片段。

1.2.3 产物纯化、序列测定及分析 PCR 产物纯化（生工SK1141）后送至上海生工生物工程技术服务有限公司，在ABI3730自动测序仪上应用相应的PCR 引物进行双向直接序列测定，测序结果使用DNAStar软件进行分析。发现的序列变异在NCBI和Hapmap的多态数据库中进行查询，确定是否为单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）。通过同时检测家系内所有患者及其健康同胞的相应序列，鉴定变异序列是否与疾病表型共分离。

2 结 果

该家系共有存活耳聋患者3例，从家系图分析，符合常染色体显性遗传；所有患者均为语后聋，为双耳对称性、进行性、高频听力下降为主的感觉神经性聋，随年龄增加耳聋程度逐步加重，最终进展为全频受累的重度感音神经性聋。患者出现听力下降的年龄，从12～25岁。Ⅱ2，女，65岁，16岁出现听力下降，48岁发展为全聋，目前左耳听力为75分贝，右耳听力为80分贝。Ⅱ5，男，55岁，25 岁出现听力下降，42 岁发展为全聋，目前左耳听力为85分贝，右耳听力为84分贝。

直接双向测序后，发现GJB2基因的6个变异序列（表2、图2），这些变异既存在于部分患者中，也在健康亲属中检测到，与疾病不存在共分离。本研究中发现的GJB2基因的核苷酸改变是SNP。

图2 GJB2基因中检测到的核苷酸变异序列

表2 GJB2基因中检测到的变异序列

3 讨 论

耳聋是导致交流障碍最常见的疾病，大多数发病都与遗传有关。遗传性耳聋患者中70%以上为NSHL。耳聋具有高度的遗传异质性，相关基因众多，但在不同人群中GJB2基因突变均是导致NSHL的最主要致病基因［4］。Mignon 等［5］于1996年将人类GJB2定位于13q11-q12，基因全长5 510bp，含两个外显子，而编码序列位于exon2，长为681bp。GJB2含有226个氨基酸的蛋白质，相对分子质量约为26×103，也称缝隙连接蛋白26（connexin 26，Cx26）。Cx26是一种跨膜蛋白，4次跨膜，共分5个区：N 端区、跨膜区、细胞外区、胞浆内连接区和C端区。Cx26蛋白以六聚体形式结合形成缝隙连接，形成耳蜗内钾离子运输通道，以维持耳蜗内较高水平电位［6］。GJB2基因突变可导致Cx26 蛋白功能缺陷，减少钾离子再循环效率，进而导致听力损害［7］。目前发现，GJB2至少有111种突变可以引起NSHI，其中显性突变9 种，隐性突变92 种，遗传模式不明突变10种。

本研究的NSHL家系中，所有患者均为语后聋，为双耳对称性、进行性、高频听力下降为主的感觉神经性聋，不伴其他器官系统的异常。根据其临床特征和遗传方式，作者认为该家系属于常染色体显性遗传的非综合征型耳聋。进一步用分子遗传学方法尝试了GJB2 基因的突变筛查，寻找患者特有的突变。检测到的6个变异序列既存在于患者中，也出现在患者的健康亲属中，未发现与疾病表型共分离的变异。其中c.79G＞A（p.Val27Ile）和c.341G＞A（p.Glu114Gly）为已报道的核苷酸多态，而位于3′-UTR 的g.4159T＞C、g.5142G／T、g.5227G／A、g.5352T／C突变为本研究国内外首次报道。尽管本研究在GJB2基因的编码区发现了2个杂合突变79G＞A（p.Val27Ile）和341G＞A（p.Glu114Gly），但在该家系患者和健康人中均存在这些突变，因此，作者认为它们更可能是该基因的SNP，这与大多数研究者认为杂合突变79G＞A 和341G＞A是GJB2基因的多态相一致的［8-10］。所以，作者初步排除了GJB2为本研究NSHL家系的致病基因，说明遗传性非综合征型耳聋存在明显的遗传异质性。

［1］ Walsh T，Pierce SB，Lenz DR，et al.Genomic duplication and overexpression of TJP2／ZO-2leads to altered expression of apoptosis genes in progressive nonsyndromic hearing loss DFNA51［J］.Am J Hum Genet，2010，87（2）：101-109.

［2］ Walsh T，Shahin H，Elkan-Miller T，et al.Whole exome sequencing and homozygosity mapping identify mutation in the cell polarity protein GPSM2as the cause of nonsyndromic hearing loss DFNB82 ［J］.Am J Hum Genet，2010，87（1）：90-94.

［3］ Xiao ZA，Xie DH.GJB2（Cx26）gene mutations in Chinese patients with congenital sensorineural deafness and a report of one novel mutation［J］.Chin Med J（Engl），2004，117（20）：1797-1801.

［4］ Kim HJ，Park CH，Kim HJ，et al.Sequence variations and haplotypes of the GJB2gene revealed by resequencing of 192chromosomes from the general population in Korea［J］.Clin Exp Otorhinolaryngol，2010，3（1）：65-69.

［5］ Mignon C，Fromaget C，Mattei MG，et al.Assignment of connexin 26（GJB2）and 46（GJA3）genes to human chromosome 13q11-q12and mouse chromosome 14D1-E1by in situ hybridization［J］.Cytogenet Cell Genet，1996，72（2／3）：185-186.

［6］ Su CC，Li SY，Su MC，et al.Mutation R184Qof connexin 26in hearing loss patients has a dominant-negative effect on connexin 26and connexin 30［J］.Eur J Hum Genet，2010，18（12）：1061-1064.

［7］ Terrinoni A，Codispoti A，Serra V，et al.Connexin 26（GJB2）mutations as a cause of the KID syndrome with hearing loss［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，395（1）：25-30.

［8］ Kelley PM，Harris DJ，Comer BC，et al.Novel mutations in the connexin 26gene（GJB2）that cause autosomal recessive（DFNBl）hearing loss［J］.Am J Hum Genet，1998，62（4）：792-799.

［9］ Abe S，Usami S，Shinkawa S，et al.Prevalent counexin 26 gene（GJB2）mutations in Japanese ［J］.J Med Genet，2000，37（1）：41-43.

［10］ 肖自安，冯永，潘乾.非综合征性耳聋患者连接蛋白26基因突变的研究［J］.中华耳鼻咽喉科学杂志，2000，35（3）：188-191.