沙棘总黄酮防紫外线损伤的实验研究

2015-03-04徐敏

重庆医学 2015年33期

徐敏

（安顺职业技术学院应用医药系，贵州安顺561000）

沙棘总黄酮是胡颓子科沙棘属沙棘的主要活性成分。沙棘别名醋柳、酸柳果，为落叶性小乔木或灌木［1-4］。沙棘在我国资源丰富，尤其是食用和药用价值世界公认，因此合理开发沙棘资源，提高沙棘资源的附加值具有重要的意义［5］。沙棘的生态价值、营养价值和药用价值都很高。沙棘是具有枝叶茂密、根系发达、生长迅速、抗干旱、御严寒、保持水土、防风固沙、改良土壤、适应性强等特点的优质植物，其内含有蛋白质、糖类、脂类、维生素等多种营养物质。另外，沙棘因富含多种生物活性成分尤其是沙棘中的黄酮类化合物具有重要的药用价值。沙棘总黄酮在心血管、消化、呼吸、抗肿瘤、抗衰老、提高机体免疫力等多方面具有治疗优势，具有活血、养胃、健脾、利肺、祛痰等药理功效，在临床上有着广泛前景及应用价值，并记载在古代的《月王药珍》、《四部医典》和《晶珠本草》等医书中［6-7］。沙棘总黄酮还可吸收紫外线，有直接捕获超氧自由基和羟基自由基的作用，对皮肤系统具有清除自由基、抗氧化、抗辐射、抗衰老的作用［8-9］。本实验采用从一次利用后的高原沙棘果渣和籽渣中提取黄酮，通过对小鼠中波紫外线（UVB）辐射皮肤损伤模型的影响，初探其抗紫外线辐射的作用，以便为深度开发和综合利用沙棘资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 KM 小鼠，雌性，42～56d，体质量22～25g，购自贵阳医学院实验动物中心，按清洁动物标准条件分笼喂养。

1.2 药品及试剂 1%沙棘总黄酮提取物自制药物；高原护肤霜由第二军医大学药学院研制生产；6%硫化钠，成都化学试剂厂；1%戊巴比妥钠，北京普博斯生物科技有限公司；羟脯氨酸标准品由中国药品生物制品检定所提供；考马斯亮蓝蛋白测试、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒均是南京建成生物工程研究所产品。

1.3 方法

1.3.1 沙棘总黄酮的提取沙棘除汁，晾干，用中药粉碎机粉碎，60℃烘干12h，用超临界CO2萃取装置去油。称取去油粉末100g，用超声波以5倍体积的纯水萃取1h，过滤得滤液Ⅰ；滤渣重复萃取，过滤得滤液Ⅱ；合并滤液Ⅰ、Ⅱ。60 ℃以下减压蒸馏浓缩，然后加95%乙醇至60%醇沉，放置低温过夜。过滤溶液，4 000r／min离心，取液体减压蒸馏，回收乙醇，浓缩液体。冷冻干燥得20mg干粉，所得干粉即沙棘总黄酮给药组的主要成分。

1.3.2 UVB辐射小鼠皮肤损伤模型的构建、分组设计、给药途径［10-14］小鼠注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，并把小鼠背部鼠毛剪短至1 mm，用配制好6%Na2S 液体脱掉面积约为5cm×5cm 的鼠毛。将已脱毛的小鼠分为4 组，每组10 只：正常对照组（正常组）﹑UVB照射组（模型组）﹑UVB照射＋高原护肤霜（阳性对照组）﹑ UVB照射＋1%沙棘总黄酮给药组（沙棘总黄酮给药组）。给予普通基础颗粒饲料，每日1次。正常组不做UVB照射，模型组只做UVB 照射。阳性对照组和沙棘总黄酮给药组的小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，皆为均匀的一层覆盖涂抹给药，10min后与模型组一起置于40w 紫外光源下（光源距小鼠皮肤垂直距离为35cm）UVB 辐射20 min（辐照强度为0.17mW／cm2，放射270～400nm 连续波谱，光谱集中在313nm）。持续相同时间辐射7d，第7天辐射结束后24h内，把小鼠背部脱毛区的皮肤取下，然后去除血液和皮下脂肪，并用生理盐水漂洗，最后固定和冷冻保存以备用。

1.3.3 制作病理切片将取材的部分皮肤组织，放入固定液（10%福尔马林溶液）固定，石蜡包埋，用切片机切成薄片，一般为厚为4μm，用苏木精-伊红（HE）染色法染色，显微镜下观察病理变化。

1.3.4 制备皮肤组织匀浆用滤纸将取材的部分皮肤组织拭干称取组织质量，加9倍的组织质量的预冷的匀浆介质放在冰上，并将组织充分剪碎进行匀浆，在冰浴中多次研磨以研碎皮肤组织，匀浆后皮肤组织用低温高速离心机4 000r／min离心15min，取适量上清液待测。组织匀浆上清液中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法（Bradford法）检测，以牛血清清蛋白为标准绘制标准曲线。

1.3.5 SOD 活性的测定 SOD 活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法，具体测定按测试盒说明书进行。

1.3.6 MDA 量的测定MDA量的测定采用TBA法，具体测定按测试盒说明书进行。

1.3.7 胶原蛋白量的测定胶原蛋白中的羟脯氨酸占其总氨基酸的13.4%［15］，分析其中羟脯氨酸的含量，可换算出胶原蛋白的量［16］。羟脯氨酸含量的测定用氯胺-T 法：即氯胺-T 作为氧化剂能把羟脯氨酸氧化，再用高氯酸终止氧化，最后加入对二甲氨基苯甲醛溶液生成紫红色化合物进行比色测定；然后取不同量的羟脯氨酸标准品制作标准曲线；最后根据胶原蛋白量＝羟脯氨酸测定浓度／组织质量／0.134，计算出胶原蛋白的量。

1.4 统计学处理采用SPSS12.0统计软件进行分析处理，计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验期间小鼠的皮肤形态学观察正常组小鼠皮肤各层细胞纹理清晰，有较薄的真皮层，有排列有序的波浪状弹性纤维，未见盘曲打结、聚集成团的现象，有束状定向疏松排列的胶原纤维，皮肤附属器完整。模型组小鼠皮肤有层次增加的表皮细胞，有增厚的真皮层，有呈嗜碱性变、无定形、破坏、变粗、盘曲打结、聚集成团、甚至消失的弹性纤维，有不规则排列、粗大致密的胶原纤维，皮肤附属器缺失。阳性对照组小鼠皮肤有呈结节状或旋涡状不规则排列、粗大致密的胶原纤维。沙棘总黄酮给药组小鼠皮肤和模型组相比，表皮及其附属器较完整，真皮层中弹性纤维破坏较小，有排列较规则的胶原纤维。见图1。

图1 各组小鼠皮肤组织HE染色（×100）

表1 UVB辐射后小鼠皮肤组织SOD、MDA 和胶原蛋白含量变化（±s，n＝10）

＃：P＜0.01，＊：P＜0.05，与正常组比较；△：P＜0.01，与模型组比较。

组别 SOD（U／mg） MDA（nmol／mg）胶原蛋白含量（μg／mg）正常组84.25±7.87 1.82±0.33 1.26±0.10模型组 61.17±3.59＃ 3.19±0.45＃ 1.01±0.09＊阳性对照组 75.10±6.27△ 1.63±0.26△ 1.79±0.15△沙棘总黄酮给药组 72.41±4.05△ 1.45±0.30△ 1.38±0.14△

2.2 小鼠皮肤组织SOD 活性测定结果模型组小鼠经UVB辐射后，与正常组相比，皮肤组织中的SOD 活性极显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，阳性对照组和沙棘总黄酮给药组SOD 的活性极显著升高（P＜0.01）。见表1。

2.3 小鼠皮肤组织MDA 量的检测结果与正常组比较，模型组含MDA 的量多（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组和沙棘总黄酮给药组含MDA 的量少（P＜0.01）。见表1。

2.4 小鼠皮肤组织胶原蛋白量的测定结果与正常组比较，模型组小鼠胶原蛋白的量降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和沙棘总黄酮给药组较高（P＜0.01），而阳性对照组产生了增生性瘢痕。

3 讨论

本实验选7dUVB辐射小鼠，展示UVB累加损伤皮肤的过程，客观具体地模拟了生活中UVB对皮肤的损害。紫外线根据波段可分为长波紫外线（UVA）、UVB、短波紫外线（UVC）。大量资料显示，UVB 是预防皮肤光老化的重点［14］。所以，本实验选择UVB为主要波段的光源。本实验通过UVB辐射小鼠来构建皮肤损伤模型，并把小鼠背部脱毛区的皮肤取下做组织病理切片，进行病理学观察。模型组小鼠皮肤形态学变化明显，表皮细胞层增加，真皮层增厚，说明成功造模，同时也验证了长时间UVB 辐射可诱导皮肤的老化。紫外线引起的效应不是单个因素，而是多个因素的综合。紫外线辐射，自由基增多，使构成细胞组织的糖类、脂类、蛋白质等大分子物质被氧化而受损，从而破坏细胞的结构和功能、组织构成，导致器官老化及病变。其中构成生物膜脂类成分中的多不饱和脂肪酸由于化学性质活跃，容易被自由基破坏而形成MDA 等脂类过氧化物。因此，MDA 的量是皮肤内脂类受过氧化损伤程度的标志，间接地反映出氧自由基的含量及细胞受损伤的程度［16］。本实验中检测MDA 的量，模型组比正常组极显著增高，沙棘总黄酮给药组比模型组极显著降低，说明沙棘总黄酮在防紫外线抗氧化的作用中效果好。SOD 是人体不可缺少的一类重要的清除氧自由基的生物活性蛋白质，起到抗衰老作用，即催化并消除超氧阴离子，在维护体内自由基产生和清除的平衡中起着重要作用，故SOD 活性已成为抗衰老的重要指标［8］。本实验中，沙棘总黄酮给药组SOD 的活性极显著升高，说明沙棘总黄酮可提高SOD 的活性，减少皮肤损伤，为今后阻止和解决UVB辐射诱导的皮肤老化问题提供了支撑。

人体中含量最丰富的胶原蛋白在皮肤组成成分中占有主导地位，可使皮肤维持张力和承受外界拉力，增加皮肤弹性和韧性，使皮肤充盈和丰满。胶原蛋白是惟一含羟脯氨酸较多的蛋白质，因此，测定胶原蛋白的量可通过羟脯氨酸的量来确定。本实验的检测结果表明，沙棘总黄酮给药组胶原蛋白的量比模型组极显著的升高，说明沙棘总黄酮对皮肤中胶原的合成和分泌具有促进作用。阳性对照组胶原蛋白的量最高，并产生了增生性瘢痕。增生性瘢痕与胶原的代谢失平衡有关，瘢痕组织中胶原合成和降解都增加，但胶原合成超过降解，使其过度沉着，由此产生了瘢痕增生。

总之，沙棘总黄酮可防止氧化损伤，增强胶原蛋白的合成和分泌，抑制瘢痕增生，从而为其用于防紫外线损伤提供了有利的证据，但沙棘总黄酮用于防紫外线损伤的机制还需要进一步研究与探索。

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