逍遥散对阿尔茨海默病模型大鼠海马mRNA 表达的影响

2015-03-04李高申郭梅珍赵唯贤黄河科技学院河南郑州450006

中国老年学杂志 2015年15期

李高申　郭梅珍　赵唯贤(黄河科技学院，河南　郑州　450006)

李高申郭梅珍赵唯贤1
(黄河科技学院，河南郑州450006)

〔摘要〕目的探讨疏肝理气方剂逍遥散对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马mRNA表达的影响。方法将4～5个月鼠龄，体重(250± 20) g的清洁级SD雄性大鼠随机分为4组，其中模型组、西药组、中药组采用D-gal腹腔注射和Aβ1～42双侧海马注射联合造模;生理组采用等体积灭菌生理盐水按上述方法象征性造模。造模完成后，生理组、模型组以生理盐水灌胃，西药组和中药组分别采用奥拉西坦溶液和逍遥散煎剂灌胃。四组均每日1次，连续灌胃28 d，用药体积0.5 ml/100 g。结果经灌胃干预后，中药组水迷宫成绩较模型组提高明显(P＜0.01) ;大鼠海马中蛋白磷酸酶-2A基因表达明显增加(P＜0.01)，细胞依赖性蛋白激酶-5、糖原合成酶激酶-3β的基因表达明显减少(P＜0.01)。结论逍遥散通过上调蛋白磷酸酶-2A基因表达和下调细胞依赖性蛋白激酶-5、糖原合成酶激酶-3β基因表达，对凝聚态Aβ1～42peptide诱导的海马Tau蛋白过度磷酸化有一定抑制作用，对大鼠AD模型记忆能力的改善起到了一定影响。

〔关键词〕逍遥散;阿尔茨海默病;糖原合成酶激酶-3β;细胞依赖性蛋白激酶-5;蛋白磷酸酶-2A

1河南医学高等专科学校

第一作者:李高申(1971-)，男，硕士，副教授，主要从事中医教学与基础研究。

阿尔茨海默病(AD)是以渐进性记忆、认知功能障碍为特点的中枢神经系统退行性疾病，神经元内神经元纤维缠结是AD的重要病理学特征。本研究拟观察逍遥散对调控AD Tau蛋白过度磷酸化相关蛋白激酶及蛋白磷酸酶基因表达水平的影响，旨在为筛选有效抗AD中药提供依据。

1　材料与方法

1.1动物清洁级SD雄性大鼠，鼠龄4～5个月，体重(250± 20) g，购自河南省实验动物中心，批号: SCXX(豫) 2010-0002。

1.2药物逍遥散煎剂(组成:柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷)各药间质量比例按原方10∶10∶10∶10∶10∶5∶1∶1配比，由本课题组在每日用药前2 h，严格按照中药煎剂制备流程自行制作，最后经水浴箱蒸发浓缩至含生药2 g/ml的药液浓度，晾至常温备用。奥拉西坦胶囊(石药集团欧意药业有限公司提供，400 mg/粒，批号: 05110703)，用药前，将奥拉西坦药粉用常温蒸馏水稀释成150 mg/ml的奥拉西坦溶液备用。

1.3试剂D-半乳糖(D-gal)，Genview公司生产，北京鼎国昌盛生物技术有限公司分装，批号22L10133;β-淀粉样蛋白(Aβ) 1～42，北京博奥森生物技术有限公司提供，批号: 990901;海马蛋白磷酸酶(PP) -2A抗体，abgent生产，编号AJ1644a;糖原合成酶激酶(GSK) -3β抗体，GST生产，编号9315s。

1.4仪器蓝星B型脑立体定位仪2H，安徽淮北正华生物仪器设备有限公司生产; DMS2型Morris水迷宫系统，中国医学科学院药物研究所生产;洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂; DK-8D型电热恒温水槽，上海森信实验仪器有限公司生产。

1.5方法

1.5.1动物分组全部大鼠适应性喂养3 d，光照节律12 L: 12 D(6∶00～18∶00)，室温22℃～24℃，湿度30％～40％，自由饮水，喂食河南省实验动物中心提供的普通大鼠颗粒饲料。将每只大鼠用苦味酸进行染色标记，水迷宫连续训练3 d，留用寻找平台平均时间较短者作为实验用鼠，并随机分为四组(生理组、模型组、西药组、中药组)，每组7只。

1.5.2模型制备模型组、西药组、中药组均采用D-gal腹腔注射和Aβ1～42双侧海马注射联合造模〔1〕:①每天9∶00～10∶00，按1 ml/100 g的剂量分别对各组大鼠腹腔注射D-gal溶液(浓度10 mg/ml)，连续42 d;②将Aβ1～42加生理盐水稀释成5 μg/μl的溶液，震荡溶解，密封，37℃温箱中孵育7 d，使其变为凝聚态Aβ，放入4℃冰箱保存备用。自D-gal造模次日(第43天)，大鼠经10％水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，常规皮肤消毒，头部正中矢状切口，以前囟为基准点，后移4 mm，左右旁移2 mm，确定左右侧海马注射点。用牙科钻在海马注射点钻开颅骨，暴露硬脑膜，用微量注射器针头进入大脑1.6 mm到达海马组织。在20 min内将2 μl Aβ缓慢注入双侧海马，以保证溶液充分弥散。然后缓慢撤针，以灭菌骨蜡填补骨孔，缝合皮肤，碘伏消毒。每只腹腔注射青霉素钠预防感染，1次/d，连用3 d。常规饲养。生理组用等体积灭菌生理盐水做上述操作完成造模。

1.5.3药物干预造模结束后的第4天，每日9∶00～11∶00进行药物灌胃干预。生理组、模型组采用生理盐水灌胃，西药组和中药组分别采用奥拉西坦溶液和逍遥散煎剂灌胃。各组均每日1次，连续28 d，用药体积均为0.5 ml/100 g。

1.5.4行为学检测〔2〕各组在药物干预结束后的次日，再次进行水迷宫行为学实验。大鼠分别自第1～4象限放入，观察并记录各象限大鼠从入水到找到安全平台所用的时间。实验每日1次，连续实验3 d，取其3 d的平均值进行统计比较。

1.6取材及实验方法

1.6.1取材行为学测试结束，各组经10％水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉，断头，在超净台内冰块上迅速剥离海马，分别放入1.5 ml灭菌离心管内，密封并标记，埋入干冰，迅速转移至－70℃低温冰箱中保存。

1.6.2RNA抽提和质量检测从少量组织(1～10 mg)或细胞(102～104)样品中抽提RNA，加入800 μl TRIZOL试剂至样品中，样品裂解后，加氯仿两相分离。质量检测主要采用紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳法〔3〕。

1.6.3引物设计由上海康成生物工程公司合成，GSK-3β正义引物: 5＇CCGCCCGGCTAACACCACTG 3＇，反义引物: 5＇GTGCTGGTCTTTCCCGCGCA 3＇，退火温度60℃，产物长度326 bp; cdk-5正义引物: 5＇CCGGGGCCGGGAGTCTTAGAA3＇，反义引物: 5＇CCGGAGGGCTGAACTTGGCAC3＇，退火温度60℃，产物长度204 bp; PP-2A正义引物: 5＇TGAGCTGCCTGCAGAAATGTAAGGC 3＇，反义引物: 5＇TCTGCAGAGCTGGGAAGCCCAA 3＇，退火温度60℃，产物长度96 bp; GAPDH正义引物: 5＇GGAAAGCTGTGGCGTGAT3＇，反义引物: 5＇AAGGTGGAAGAATGGGAGTT3＇，退火温度59℃，产物长度308 bp。

1.6.4实时定量PCR方法将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系，配置: dNTP(每个2.5 mmol/L) 1.0 μl，10×PCR缓冲液1.0 μl，MgCl2溶液0.6 μl，Taq聚合酶0.5 U，10 μmol/L的PCR特异引物各0.4 μl，2×ROX Reference Dye 0.2 μl，加水至总体积为8 μl。将384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应: GAPDH: 95℃，3 min; 40个PCR循环〔95℃，15 s; 59℃，20 s; 72℃，20 s; 83℃，20 s(收集荧光)〕。PP-2A: 95℃，3 min; 40个PCR循环〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 81℃，20 s(收集荧光)〕。GSK-3β: 95℃，3 min; 40个PCR循环〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 86℃，20 s(收集荧光)〕。cdk-5: 95℃，3 min; 40个PCR循环〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 83℃，20 s(收集荧光)〕。

1.7统计学方法应用SPSS11.5软件行单因素方差分析。

2　结果

2.1行为学实验生理组与模型组比较水迷宫成绩占明显的优势〔(12.18±1.68) s vs(18.63±1.71) s〕(P＜0.01)。药物干预后，西药组〔(15.09±2.69) s〕、中药组〔(14.66±2.78) s〕与模型组比较，水迷宫成绩提高明显(P＜0.01)。

2.2海马相关指标mRNA的表达与生理组比较，模型组PP-2A表达减少(P＜0.01)，细胞依赖性蛋白激酶-5(cdk-5)、GSK-3β表达增多(P＜0.01) ;与模型组比较，中药组海马PP-2A表达增多(P＜0.01)，cdk-5、GSK-3β表达减少(P＜0.01)。见表1。

表1　各组海马相关指标mRNA表达的相对含量比较(±s)

与生理组比较: 1) P＜0.01;与模型组比较: 2) P＜0.01

组别　PP-2A/GAPDH　 cdk-5/GAPDH　 GSK-3β/GAPDH生理组　0.308 3±0.017 5　 0.106 2±0.004 5　 0.083 0±0.004 2模型组0.096 3±0.006 81)0.309 5±0.000 91)　0.267 7±0.013 51)西药组0.160 3±0.003 72)0.208 4±0.009 42)　0.162 2±0.008 92)中药组0.237 8±0.004 62)0.186 2±0.008 52)　0.125 9±0.009 12)

3　讨论

AD患病率随年龄增高而增高。在发达国家，AD已成为继心脏病、癌症、中风后的第四位死因。有资料显示，我国现有约500万AD患者〔4〕。随着人类平均寿命的延长和人口老龄化的出现，AD对人类健康的危害将变得日益突出。

Aβ是老年斑(SP)的主要成分，其大量沉积可能是所有因素引起AD的共同途径。Aβ的神经毒性作用已被公认为是AD形成的核心环节，减少Aβ的形成、抑制Aβ的沉积，是预防和治疗AD的根本途径〔5〕。

tau蛋白的病理变化出现在AD早期，有资料显示大多数病人脑脊液中的tau蛋白升高，而量化测定脑脊液中的tau蛋白可能成为AD早期诊断的一项有用指标〔6〕。CDK-5和GSK-3β属于蛋白激酶，其活性的增加可使tau蛋白发生异常磷酸化。CDK-5基因在大鼠脑组织中的过量表达常导致动物出现AD样tau过度磷酸化和空间记忆障碍〔7〕;而PP-2A属于蛋白磷酸酯酶，在信号传导中承担负性调节作用，其活性增加可使过度磷酸化的tau蛋白发生去磷酸化〔8〕。本研究结果也表明了PP-2A基因表达形式与CDK-5、GSK-3β基因表达呈负相关。

中医临床将AD归属于呆病门类，其发病和心、肝、脾、肾都有密切联系，目前较多的研究主要集中在肾功能失调方面，多采用补肾益智方药治疗〔9〕。但是，肝在痴呆发病中也居重要地位。肝疏泄功能失常，肝气郁滞，失其调达之性，其调节情志、调畅气机功能障碍，气血运行不畅，可导致健忘(痴呆)。如《素问·玉机真脏论》曰:“春脉如弦，......太过则令人善忘，忽忽眩晕而巅疾”。陈士铎在《辨证录》中指出，“人有气郁不舒，忽忽如有所失，目前之事竟不记忆，一如老人之善忘，此乃肝气之滞，非心肾之虚耗也”。疏肝理气法可以运用到记忆、认知障碍疾病的临床治疗中〔10〕。

逍遥散是肝郁血虚，脾失健运的重要方剂。方中有柴胡疏肝解郁，当归、白芍养血柔肝，白术、茯苓健脾去湿，炙甘草益气补中，生姜温胃和中，薄荷助柴胡疏肝解郁，体现了肝脾同治，重在治肝之法。现代研究表明，柴胡能改善脑细胞代谢和脑循环，延缓衰老引起的活性氧自由基的反应速度;当归对脑缺血引起的空间认知障碍有一定改善作用;白芍总苷能改善东莨菪碱诱发的小鼠空间识别障碍;茯苓长期服用可使老龄大鼠内在性胆碱和乙酰辅酶-A的含量增加，有抑制抗胆碱的作用。以疏肝解郁为主治疗AD，除有助于改善患者的记忆力减退等症状外，还可显著改善其情绪抑郁、反应迟钝的状态，这对于减轻进一步的智能损害、防止病情加重具有重要的临床意义〔11〕。

综上，逍遥散改善了模型大鼠的认知障碍。逍遥散可能上调PP-2A的表达和下调CDK-5、GSK-3β的表达，进而对凝聚态的Aβ1～42诱导的海马Tau蛋白过度磷酸化起到了一定的抑制作用，对AD模型大鼠起到了一定的治疗作用。

4　参考文献

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10黄书慧.颜乾麟运用古方治疗老年性痴呆经验〔J〕．中医杂志，2008; 49(2) : 112-3.

11朱振铎，霍青，薛一涛.疏肝解郁，滋肾养心法治疗老年性痴呆34例临床研究〔J〕．山东中医药大学学报，1998; 22(5) : 346-8.

〔2015-03-17修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者:郭梅珍(1971-)，女，讲师，主要从事中医药教学与基础研究。

基金项目:河南省2012年度科技计划项目(No．122102310410) ;河南省教育厅青年骨干教师资助项目(No．2011GGJS-220)

〔中图分类号〕R749

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 15-4199-03;