miRNA-182通过调节EMT 相关分子ZEB2而抑制肺癌细胞转移和侵袭

朱志军　薛亚军　朱佳龙(石河子大学医学院第一附属医院心胸外科，新疆　石河子　832000)

miRNA-182通过调节EMT 相关分子ZEB2而抑制肺癌细胞转移和侵袭

朱志军薛亚军朱佳龙
(石河子大学医学院第一附属医院心胸外科，新疆石河子832000)

〔摘要〕目的探讨微小RNA(miRNA) -182对肺癌细胞转移和侵袭的影响及其相关机制。方法采用荧光定量PCR方法检测肺癌细胞系和组织标本中miRNA-182表达情况;对miRNA-182表达情况与肺癌临床病理特征关系进行分析;通过Boyden小室分析和伤口愈合实验检测miRNA-182对肺癌细胞转移和侵袭能力的影响;生物信息学方法预测miRNA-182可能的靶基因，并采用荧光素酶报告基因实验验证预测的靶基因E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)是miRNA-182的靶基因; Western印迹方法检测ZEB2、E-钙黏蛋白和波形蛋白的表达情况。结果四种肺癌细胞系miRNA-182 mRNA的表达情况为高转移能力的肺癌细胞系95D和L9981其miRNA-182 mRNA表达显著低于转移能力较弱的肺癌细胞系NL9980或95C(P＜0.05)，且同原发性肺癌组织相比，淋巴结转移癌组织中miRNA-182表达亦显著下调(P＜0.05) ;临床病理特征关系分析结果显示，miRNA-182表达仅与是否存在淋巴结转移相关。转染miRNA-182可显著抑制肺癌细胞系95D和L9981的转移(P＜0.05)，同时，转染miRNA-182可显著抑制肺癌细胞系95D和L9981的侵袭能力(P＜0.05)，而转染miRNA-182抑制剂可增加肺癌细胞系95D和L9981的侵袭能力(P＜0.05)。生物信息学预测显示ZEB2为miRNA-182的功能性靶基因，且得到荧光素报告实验结果证实。Western印迹结果显示转染miRNA-182可显著抑制肺癌细胞系95D和L9981中ZEB2和波形蛋白的表达，上调E-钙黏蛋白的表达。结论miRNA-182可通过调节ZEB2、E-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，进而抑制肺癌细胞的转移和侵袭。

〔关键词〕肺癌; miRNA-182 ;细胞转移;细胞侵袭; E盒结合锌指蛋白2

第一作者:朱志军(1979-)，男，硕士，主治医师，主要从事心胸外科相关疾病。

微小RNA(microRNA，miRNA)可在转绿后水平对基因的表达进行负调控〔1〕。miRNA在许多生物过程，包括发育、分化、凋亡、代谢、免疫和肿瘤进展中具有重要的作用。越来越多的证据表明，miRNA可调控肿瘤的发生和发展，并在肿瘤细胞的转移和侵袭中具有重要的作用〔2，3〕。因此，miRNA可能参与调解肺癌的发生、发展的重要环节。然而，关于miRNA-182在肺癌发生发展中的具体作用及相关机制尚未明确。本研究通过观察肺癌细胞和组织标本中miRNA-182表达情况，分析其与肺癌临床病理特征的关系，并在体外转染miRNA-182后观察肺癌细胞转移和侵袭能力的变化，验证miRNA-182的靶基因E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)，检测miRNA-182对ZEB2、E-钙黏蛋白和波形蛋白表达水平的影响，进而探讨miRNA-182在肺癌发生发展中的作用及相关机制。

1　材料与方法

1.1细胞及主要试剂人肺癌细胞系NL9980和L9981由四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室惠赠，95C和95D由上海复旦大学生物化学与分子生物学重点实验室惠赠，细胞培养于含10％胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培养基中。转染试剂Lipofectamine2000及TRIzol购自美国Invitrogen公司，SYBR Green PCR试剂盒、miRNA-182、阴性对照(NC)、antimiRNA-NC和anti-miRNA-182购自Ambion公司;侵袭实验用Boyden小室购自美国Millipore公司;荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司; ZEB2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2荧光定量PCR Trizol提取细胞总RNA，反转录成cDNA。PCR反应条件: 95℃5 min，95℃10 s，60℃20 s，共40个循环。引物序列: miRNA-182上游引物: 5'-TTTGGCAATGGTAGAACTCACACT-3'，下游引物: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG-3';内参照U6上游引物: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。得到的数据通过比较Ct值法(2－△△Ct)进行定量分析。

1.3细胞转染细胞长至70％融合时可用于转染。严格按照Lipofectamine2000转染说明书进行操作，转染36 h后可用于功能实验。

1.4转移和侵袭能力检测采用伤口愈合实验方法检测细胞转移能力，具体操作方法参见文献报道〔4〕。采用Boyden小室分析检测细胞侵袭能力，具体步骤:用于实验的细胞采用台盼蓝染色计数并重悬。将1×105个细胞置于小室上层，并补加培养基至300 μl。下层小室中加入含10％胎牛血清的培养基500 μl。孵育12 h后，未发生侵袭的细胞用棉拭子从上层腔室除去。下层小室中的细胞以0.1％结晶紫固定染色，计算出现侵袭的细胞数。

1.5生物信息学方法预测miRNA-182靶基因通过靶基因预测软件联合筛选出ZEB2作为miRNA-182的靶基因。

1.6荧光素酶报告基因验证靶基因miRNA靶点预测软件提示ZEB2 mRNA的3'端的非翻译区(3'UTR)的位点1303～1310 是miRNA-182的可能结合位点(BS)，体外合成含该位点的DNA片段及含该位点突变体的DNA片段，克隆至双荧光素酶启动子载体pMIR: pMIR-ZEB2-3'-UTR-wt和pMIR-ZEB2-3'-UTR-mut。将pMIR-ZEB2-3'-UTR-wt或pMIR-ZEB2-3'-UTR-mut 及miRNA-182共同转染至肺癌细胞中，培养48 h后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.7Western印迹等量提取细胞蛋白经8％～10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸铵凝胶(SDS-PAGE)分离胶和5％浓缩胶分离后，半干转印至硝酸纤维素膜上，以含5％ BSA的Tris盐酸缓冲液(TBST)室温封闭1 h，加入一抗4℃过夜孵育。第2天用0.1％ TBST洗膜3次，5 min/次，加入相应的HRP标记的二抗，室温孵育1 h。0.1％ TBST洗膜后，硝酸纤维素膜以Supersignal West Femto HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。β-actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。

1.8统计学方法应用SPSS16.0软件进行t检验。

2　结果

2.1肺癌细胞和组织标本中miRNA-182表达情况四种具有不同转移能力的肺癌细胞系miRNA-182表达高低不同，同转移能力较弱的肺癌细胞系NL9980(0.36±0.03)或95C(0.19± 0.03)相比，具有高转移能力的肺癌细胞系95D(0.05±0.02)和L9981(0.04±0.02)其miRNA-182 mRNA表达显著下调(P＜0.05)。同时，与原发性肺癌组织(0.11±0.06)相比，淋巴结转移癌组织中miRNA-182 mRNA表达亦显著下调(P＜0.05)。

2.2miRNA-182表达与肺癌临床病理特征的关系miRNA-182在肺癌组织的表达水平仅与患者有无淋巴结转移密切相关(P＜0.05)，而与患者年龄、性别、是否吸烟和临床分期均无明显关系(P＞0.05)。见表1。

表1　miRNA-182表达量与肺癌组织临床病理特征的关系

2.3miRNA-182对肺癌细胞转移和侵袭的影响伤口愈合实验显示，与对照组相比，miRNA-182可显著抑制肺癌细胞系95D和L9981的转移(P＜0.05) (图2A)。与对照组相比，转染miRNA-182可显著抑制肺癌细胞系95D和L9981的侵袭能力(P＜0.05)，而转染miRNA-182抑制剂可增加肺癌细胞系95D 和L9981的侵袭能力(P＜0.05) (图2B)。

图1　miRNA-182对肺癌细胞转移和侵袭的影响

2.4miRNA-182靶基因预测通过靶基因预测软件寻找miRNA-182可能作用的靶基因，结果提示ZEB2可能为miRNA-182的功能性靶基因，且为感兴趣的基因。miRNA-182预测结合的ZEB2 3'-UTR的靶位点见图2。为确定miRNA-182是否和ZEB2间存在直接的相互作用，构建了含野生型和突变型ZEB2 的3'-UTR序列的pMIR载体。结果显示，与对照组(1.01± 0.13)相比，共转染野生型pMIR-ZEB2 3'-UTR载体和miRNA-182，荧光素酶活性(0.57±0.04)显著降低(P＜0.05) ;与对照组(1.02±0.2)相比，共转染突变型pMIR-ZEB2 3'-UTR载体和miRNA-182的荧光素酶活性(1.12±0.16)未出现显著性改变(P＞0.05)。

图2　miRNA-182靶基因预测及验证

2.5miRNA-182对肺癌细胞ZEB2表达的影响miRNA-182 miRNA-182可显著抑制肺癌细胞系95D和L9981中ZEB2的表达，上调与上皮-间质转化(EMT)相关E-cadherin表达，并下调EMT相关Vimentin的表达。见图3。

图3　Western印迹检测miRNA-182对肺癌细胞中EMT相关蛋白表达的影响

3　讨论

miRNA是一类小的，非编码RNAs，长度约为19～25个核苷酸。近年来，许多研究表明miRNA在人类癌症的发生发展中具有重要的作用。然而关于miRNA-182在肺癌发生发展中的作用及相关机制尚未研究清楚。关于miRNA-182在恶性肿瘤中表达及作用的文献报道还很少，且存在矛盾之处。Moskwa等〔5〕的研究证实，在恶性度较高的乳腺癌细胞中miRNA-182的表达显著低于恶性度较低的乳腺癌细胞;结果与Patryk等的研究结果基本一致。其他文献报道〔6〕，高表达miRNA-182的ER+乳腺癌患者，其对内分泌治疗敏感，无复发，生存期长，且miRNA-182与淋巴结转移呈负相关，结果与文献报道一致。然而也有文献报道〔7～9〕，在结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌等癌组织中miRNA-182表达显著上调。这可能是由于miRNA-182在不同的肿瘤组织中其调控的靶基因不尽相同，而其下游靶基因的生物学效应决定了miRNA-182的作用〔10〕。同时，实验样本的选取和实验方法的不同也可能会造成结果的不一致。

正因为miRNAs下游靶基因的生物学效应决定了miRNAs的作用。本研究通过靶基因预测软件联合筛选出miRNA-182的靶基因，在众多靶基因中，因ZEB2在人类癌症的发生发展中具有重要的作用，而成为我们感兴趣的靶基因。ZEB2已证实在多种癌症的发展中发挥着重要的作用，如胃癌，卵巢癌，鳞状细胞癌和非小细胞肺癌〔11〕。在EMT过程中，ZEB2通过结合于E-钙黏蛋白启动子区的CACCT(G)基序而特异性地抑制E-钙粘蛋白的表达〔12〕。本研究结果提示miRNA-182可能是通过调节ZEB2的表达而抑制肺癌细胞的转移和侵袭能力。EMT过程是肿瘤转移的主要机制。肿瘤细胞从原发灶穿透基底膜而转移至血液循环，这一过程包括了上皮特异性E-钙黏蛋白和间质标志物波形蛋白的重新分布。

综上，miRNA-182可能是一类新的肿瘤抑制miRNA。miRNA-182可通过调节EMT相关ZEB2而抑制肺癌的转移和侵袭，为肺癌的发生发展提供了一种新的见解。此外，在肺癌治疗中，miRNA-182可作为一种潜在的治疗靶点。

4　参考文献

1鲁艳明，银铎，王宁，等.miRNA-200c对卵巢癌细胞侵袭能力影响观察〔J〕．中华肿瘤防治杂志，2014; 21(10) : 732-5.

2王球玉，唐珺，周欣想，等.miR-129在乳腺癌中表达下调及其对乳腺癌细胞迁移运动的影响〔J〕．生理学报，2012; 64(4) : 403-11．

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4Liu S，Li L，Zhang Y，et al．The oncoprotein HBXIP uses two pathways to up-regulate S100A4 in promotion of growth and migration of breast cancer cells〔J〕．J Biol Chem，2012; 287(36) : 30228-39.

5Moskwa P，Buffa FM，Pan Y，et al．miR-182-mediated downregulation of BRCA1 impacts DNA repair and sensitivity to PARP inhibitors〔J〕．Mol Cell，2011; 41(2) : 210-20.

6Rodríguez-González FG，Sieuwerts AM，Smid M，et al．MicroRNA-30c expression level is an independent predictor of clinical benefit of endocrine therapy in advanced eatrogen receptor positive breast cancer〔J〕．Breast Cancer Res Treat，2011; 127(1) : 43-51.

7Sarver AL，French AJ，Borralho PM，et al．Human colon cancer profiles show differential microRNA expression depending on mismatch repair status and are characteristic of undifferentiated proliferative states〔J〕．BMC Cancer，2009; 9: 401.

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10李谦平.miR-16-1抑制A549细胞株生物学行为及非小细胞肺癌ARID1A基因表达的研究〔D〕.上海:华中科技大学，2012: 27-9.

11Gemmill RM，Roche J，Potiron VA，et al．ZEB1-responsive genes in nonsmall cell lung cancer〔J〕．Cancer Lett，2011; 300(1) : 66-78.

12Comijn J，Berx G，Vermassen P，et al．The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates Ecadherin and induces invasion 〔J〕．Mol Cell，2001; 7(6) : 1267-78.

〔2015-03-19修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者:朱佳龙(1968-)，男，硕士，主任医师，主要从事心胸外科相关疾病。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 15-4182-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.032