β-蜕皮甾酮对实验性牙周炎大鼠症状及氧化应激的改善作用

2015-03-04天津市口腔医院牙体牙髓一科天津300041

中国老年学杂志 2015年15期

马　珅(天津市口腔医院牙体牙髓一科，天津　300041)

马珅
(天津市口腔医院牙体牙髓一科，天津300041)

〔摘要〕目的探讨β-蜕皮甾酮(EDS)对实验性牙周炎大鼠症状及氧化应激相关指标的改善作用。方法选取雄性SD大鼠(260～280 g)采用物理机械刺激法制备实验性牙周炎大鼠模型。将45只成功诱导的牙周炎大鼠模型随机分组(n = 15) :高剂量EDS(EDS-H)组、低剂量EDS (EDS-L)组及生理盐水(NS)组。EDS-H组与EDS-L组分别腹腔注射20 mg·kg－1·d－1或40 mg·kg－1·d－1EDS;同时选取15只同周龄正常大鼠作对照(C)，NS组和C组均腹腔注射等体积生理盐水。于EDS腹腔注射前后分析各组的牙龈指数(GI)和附着水平(AL)来评价症状改善情况;采用试剂盒检测牙龈组织丙二醛(MDA)、过氧化氢脂质(LPO)水平及过氧化氢酶(CAT)活性;酶联免疫吸附法检测牙龈组织中前列腺素(PG) E2和肿瘤坏死因子(TNF) -α及龈沟液中白介素(IL) -6水平;荧光探针DHE染色法及荧光免疫组化法检测牙龈组织中活性氧自由基(ROS)和基金金属蛋白(MMP) 2的表达情况。结果与C组相比，NS组的GI和AL、牙龈组织MDA、LPO、PGE2、TNF-α、ROS和MMP2的IOD水平及龈沟液中IL-6水平均升高，CAT活性降低(均P＜0.05) ;给予腹腔注射EDS可改善牙周炎大鼠的以上异常指标(P＜0.05)，EDS-H组、EDS-L组与C组的差异均有统计学意义(P＜0.05) ;且EDS-H组的以上指标均优于EDS-L组(P＜0.05)。结论EDS对实验性牙周炎大鼠的症状有较好的治疗效果，同时对牙龈氧化应激、MMP2表达及炎症反应均有较显著的改善作用。

〔关键词〕β-蜕皮甾酮;牙周炎;症状;氧化应激

第一作者:马珅(1981-)，女，博士，主治医师，主要从事牙本质粘接材料研究。

牙周疾病作为一种慢性炎症，牙周炎病灶周围的牙龈组织内可检测到炎症因子及细胞的大量聚集，多种缓解炎症反应的措施可起到较好效果〔1〕。此外，氧化应激在牙周炎发生发展中起到了重要作用，故对于牙周炎应采用缓解炎症反应和改善氧化应激的综合手段。β-蜕皮甾酮(EDS)是一种类固醇激素，已证实有多种生物活性，如清除自由基、抗氧化、缓解炎症反应及改善胰岛素抵抗等〔2～4〕。推测EDS对牙周病的防治也有一定效果。本研究采用EDS腹腔注射治疗实验性牙周炎大鼠，观察对其症状及氧化应激相关指标的影响。

1　材料与方法

1.1试剂与主要仪器EDS购自上海历鼎生物技术有限公司，Triton X-100、Tris-HCl购自美国Sigma公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析试剂盒购自美国Pierce公司，前列腺素(PG) E2、肿瘤坏死因子(TNF) -αElisa试剂盒购自南京建成生物工程研究所，白介素(IL) -6 Elisa试剂盒购自凯基生物公司，过氧化氢酶(CAT)活性试剂盒购自南京建成公司，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)试剂盒均购自美国Cayman Chemical公司，绿色标记的二抗购自上海亨代劳生物有限公司。仪器: 5424R小型台式冷冻离心机购自德国Eppendorf公司; Exl 800型酶标仪购自美国Bio-Tek公司; Mini Protean 3 Cell小型垂直电泳槽购自美国Bio-Rad公司。

1.2动物与分组选取雄性SD大鼠(260～280 g)采用物理机械刺激法制备实验性牙周炎大鼠模型，将45只成功诱导的牙周炎大鼠模型随机分组(n=15) :高剂量EDS(EDS-H)组、低剂量EDS(EDS-L)组及生理盐水(NS)组。EDS-H组与EDS-L组分别腹腔注射20 mg·kg－1·d－1或40 mg·kg－1·d－1EDS。同时选取15只同周龄正常大鼠作对照(C)，NS组和C组均腹腔注射等体积生理盐水。

1.3牙周炎模型制备采用水合氯醛麻醉，待充分麻醉后行物理机械刺激法制备牙周炎大鼠模型，借助牙钻于上颌第一磨牙牙颈处钻沟，直径0.3 mm正畸钢丝结扎牢固，连续2 d每天用沾满牙周致病菌菌液的海绵涂抹该牙，当牙龈出现脓肿及牙周脓肿时则造模成功〔5〕。

1.4症状评价分别于腹腔注射前(0 w)、注射后2、4、6、8 w测量牙龈指数(GI)和附着水平(AL)来评价症状改善情况。根据牙龈的炎症及水肿情况将GI分为4级:牙龈健康无水肿，0 分;牙龈出现轻度炎症反应、颜色改变及轻度水肿，但探查时未见出血，1分;牙龈出现中等炎症反应、颜色发红及水肿明显且探诊时出血，2分;牙龈出现严重炎症反应及溃疡且有自动出血倾向，3分。

1.5相关指标检测治疗8 w后取牙龈组织及龈沟液，冰上裂解组织后，5 000 r/min离心5 min后保留上清，采用试剂盒检测牙龈组织丙二醛(MDA)、过氧化氢脂质(LPO)水平及过氧化氢酶(CAT)活性;酶联免疫吸附法检测牙龈组织中PGE2和TNF-α及龈沟液中IL-6水平;以上操作均严格遵守试剂盒说明书。

1.6荧光探针DHE染色法取出新鲜牙龈组织，取中部冠状切面进行石蜡包埋，切成5 μm厚，加入特异性荧光探针DHE染色，避光反应15 min后，采用荧光显微镜观察，Image Pro Plus 6.0图像分析软件测定荧光积分光密度(IOD)。

1.7荧光免疫组化将1.6中制备的牙龈冠状冰冻切片，经H2O2室温孵育及山羊血清封闭后，滴加MMP2一抗(稀释度: 1∶100)，4℃孵育过夜后，滴加绿色标记的二抗，荧光显微镜下观察，用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测定IOD。

2　结果

2.1各组不同治疗时间的症状比较与C组比较，其余3组各观察点GI和AL水平升高(P＜0.05) ; EDS-H组、EDS-L组治疗2～8 w的GI和AL水平均低于NS组(P＜0.05)，且EDS-H组治疗2～8 w的后的GI和AL水平均低于QNP-L组(P＜0.05)。见图1。

图1　各组治疗不同时间的症状比较

2.2各组氧化应激相关指标水平比较与C组比较，其余3组的MDA和LPO水平均较高，CAT活性较低(P＜0.05) ; EDS-H组、EDS-L组治疗后以上指标均优于NS组(P＜0.05)，且EDS-H组对MDA、LPO水平及CAT活性的改善程度强于EDSL组(P＜0.05)。见表1。

表1　治疗8 w后牙龈组织中氧化应激相关指标水平(±s)

与C组比较: 1) P＜0.05;与NS组比较: 2) P＜0.05;与EDS-L组比较: 3) P＜0.05，下表同

组别　n　 MDA(μg/g)　 LPO(μg/g)　 CAT(U/g) C组　15　 3.13±0.56　 6.28±1.26　 35.51±2.74 NS组　10　 17.38±2.691)　24.42±2.641)　9.94±1.451)EDS-L组　10　 12.25±1.371) 2)　19.28±1.571) 2)　18.13±1.271) 2)EDS-H组　10 7.66±1.421) 2) 3)15.42±1.831) 2) 3)27.92±2.361) 2) 3)

2.3各组炎症相关因子水平比较与C组比较，其余3组牙龈组织PGE2和TNF-α水平及龈沟液中IL-6水平均较高(P＜0.05) ; EDS-H组、EDS-L组治疗后以上指标均优于NS组(P＜0.05)，且EDS-H组对PGE2、TNF-α及IL-6水平的改善程度强于EDS-L组(P＜0.05)。见表2。

表2　治疗4 w后牙龈组织及龈沟液中炎症相关因子水平(±s)

组别　n　 PGE2(μg/g)　 TNF-α(ng/g)　 IL-6(μg/L) C组　15　 3.45±0.56　 12.54±1.10　 4.11±0.72 NS组　10　 12.27±2.571)　29.71±2.671)　16.72±2.411)EDS-L组　10　 10.09±2.191) 2)　22.82±1.771) 2)　12.59±1.261) 2)EDS-H组　10　 7.31±1.641) 2) 3)17.42±2.061) 2) 3)9.64±1.241) 2) 3)

2.4各组牙龈组织ROS、MMP2水平比较与C组比较，其余3组牙龈组织ROS、MMP2水平较高(P＜0.05) ; EDS-H组、EDSL组治疗后ROS、MMP2水平均低于NS组(P＜0.05)，且EDS-H组低于EDS-L组(P＜0.05)。见表3，图2，图3。

表3　两组治疗8 w后牙龈组织中ROS和MMP2水平(±s)

组别　n　ROS　MMP2 C组　15　 54.87±9.18　68.56±12.53 NS组　10　 241.66±29.621)　345.92±34.601)EDS-L组　10　 157.41±24.731) 2)　227.54±25.621) 2)EDS-H组　10　 113.35±15.851) 2) 3)　156.19±22.481) 2) 3)

图3　治疗8 w后牙龈组织MMP2染色情况(×400)

3　讨论

牙周炎发病率高，通常伴有严重的炎症反应〔6〕，尽管具体机制尚不明确，但革兰阴性厌氧菌为主要致病菌，而有研究指出致病菌通过炎症因子引发机体免疫应答，损伤牙周组织，如不及时有效干预，可导致牙齿丧失，严重影响患者的生活质量。临床研究发现，牙周炎患者伴有严重的高炎症反应状态，且建议用炎症反应来判断病情严重程度和预测预后〔7，8〕;同时炎症反应引发的氧化应激在该病发生发展中也起到了一定作用〔9〕。故总体上改善炎症反应和氧化应激是牙周炎治疗的根本措施。

EDS是广泛存在的一种类固醇激素，不仅可主导昆虫的多种生理过程，如生殖、蜕皮及变态等，同样也可调控脊椎动物的能量代谢、调节免疫及抗氧化应激等。吴霞等〔10〕的研究发现其可通过抑制炎症反应来发挥对急性肺损伤大鼠的保护作用，显示其具有显著的抗炎功效。鉴于炎症反应和氧化应激是牙周炎的重要表现，因此推测EDS可用于牙周炎的防治。

本研究发现EDS对牙周炎症状有较好的缓解作用。此外，本研究进一步提示EDS可作为缓解牙周病的理想用药。目前，EDS可从植物中提取出来，且多项研究证实EDS可安全应用于脊椎动物中〔11〕，因此显示出其具有的应用前景。

本研究表明牙周炎大鼠中存在显著炎症反应，亦证实了牙周炎大鼠模型的成功制备。而EDS腹腔注射8 w后，提示EDS对牙周炎的炎症反应亦有较好的缓解效果，即便在较低剂量下也可观察到显著效果;但高剂量的以上3指标水平仍与正常大鼠有差异，可能与观察时间短和EDS剂量不足有关，下一步将增加EDS用量。MMP2参与了牙周炎对牙周组织的炎症破坏，MMP2在健康牙龈中表达较弱，而在牙周炎患者的牙龈组织中高表达。本研究进一步表明EDS对炎症反应的改善确切有效。

本研究表明牙周炎大鼠氧化应激反应显著。EDS腹腔注射8 w后，表明EDS可改善牙周炎大鼠的氧化应激反应。研究发现EDS对2型糖尿病大鼠肾组织氧化应激也有改善作用〔5〕，与本研究的结论一致，但具体机制尚不清楚，推测可能与缓解炎症反应有关。

综上所述，EDS对实验性牙周炎大鼠的症状有较好的治疗效果，同时对牙龈氧化应激、MMP2表达及炎症反应均有较显著的改善作用。