SLC30A8、CDKN2A/2B 、HHEX 、TCF7L2基因多态性与中国东北汉族人2型糖尿病的关联

陈　琰　赵　莹　刘桂锋(吉林大学第二医院内分泌科，吉林　长春　3004)

SLC30A8、CDKN2A/2B 、HHEX 、TCF7L2基因多态性与中国东北汉族人2型糖尿病的关联

陈琰赵莹刘桂锋1
(吉林大学第二医院内分泌科，吉林长春130041)

〔摘要〕目的探讨SLC30A8、CDKN2A/2B、HHEX、TCF7L2基因多态性与中国东北汉族人群2型糖尿病(T2DM)的相关性。方法应用连接酶检测反应(LDR)技术对中国吉林省长春地区113例T2DM患者及107例正常对照(NC)者SLC30A8基因rs13266634位点、CDKN2A/2B基因rs10811661位点、HHEX基因rs1111875位点、TCF7L2基因rs7903146位点的SNP进行检测。结果SLC30A8(rs13266634) CC、CT基因型的空腹胰岛素(FINS)、胰岛B细胞功能(HOMA-B)均低于TT基因型(P＜0．05)，总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)均高于TT基因型(P＜0．05)，CC基因型的空腹血糖(FPG)高于TT基因型(P＜0．05)。三组CC、CT、TT基因型合并心血管并发症的构成比，差异有统计学意义(P＜0．05)。CDKN2A/2B (rs10811661) TT、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于CC基因型(P＜0．05)，FPG、糖化血红蛋白(HbA1c)、TC均高于CC基因型(P＜0．05)，TT基因型的TG高于CC基因型(P＜0．05)。三组CC、CT、TT基因型合并微血管并发症的构成比差异有统计学意义(P＜0．05)。HHEX(rs1111875) GG、GA基因型的FINS、HOMA-B均低于AA基因型(P＜0．01)，FPG、TC、TG均高于AA基因型，GG基因组的低密度脂蛋白胆固醇(LDL) -C高于AA基因组(P＜0．05)。三组GG、GA、AA基因型合并心血管并发症的构成比差异有统计学意义(P＜0．05)。结论SLC30A8基因多态性位点rs13266634、HHEX基因多态性位点rs1111875与T2DM心血管并发症存在一定的相关性，CDKN2A/2B基因多态性位点rs10811661与T2DM微血管并发症存在一定的相关性。

〔关键词〕2型糖尿病;单核苷酸多态性

1吉林大学中日联谊医院放射线科

第一作者:陈琰(1982-)，女，博士，主治医师，主要从事2型糖尿病的防治研究。

2型糖尿病(T2DM)是多基因和环境因素共同作用的一种复杂性疾病。SLC30A8、CDKN2A/2B、HHEX、TCF7L2基因是2007年Nature和Science上首批鉴定出的与欧洲白种人T2DM发病相关的基因〔1～5〕，但这些变异对于具有不同遗传背景的中国东北汉族人群T2DM患病率的影响尚不清楚。本研究旨在探讨应用连接酶检测反应(LDR)技术SLC30A8基因rs13266634位点、CDKN2A/2B基因rs10811661位点、HHEX基因rs1111875位点、TCF7L2基因rs7903146位点的SNP与中国东北汉族人群T2DM的相关性。

1　材料与方法

1.1研究对象T2DM组:按知情同意的原则收集2011年12月至2013年12月在我科确诊为T2DM的门诊或住院患者113例。纳入标准:①符合1999年WHO糖尿病诊断〔空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L〕及分型标准;②半年内无酮症及其他应激情况;③无肝肾功能不全。对照组:遵循知情同意的原则收集同期在医院进行健康体检的无糖尿病家族史的健康者107例。两组研究对象均为长春地区汉族人群，且个体间无血缘关系。受试者禁食8 h以上，晨起空腹抽取肘静脉血2 ml，柠檬酸钠抗凝，用于提取基因组DNA。同时进行人体测量血并留取空腹血标本用于检测代谢指标，采用稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛β细胞功能(HOMA-B)。

1.2实验方法

1.2.1血液基因组DNA提取采用北京天根生化科技有限公司(离心柱型)试剂盒提取人基因组DNA。

1.2.2PCR反应应用生物软件Oligo6.0设计PCR引物，见表1。以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件:总体系15 μl，模板1 μl，10×buffer 1.5 μl，MgCl21.5 μl，dNTP 0.3 μl，引物混合0.15 μl，Taq酶0.3 μl。扩增条件: 94℃3 min，94℃15 s，55℃15 s，72℃30 s，35个循环，72℃3 min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检验。

表1　PCR反应引物序列

1.2.3多重LDR反应根据LDR探针设计原则设计LDR上下游探针，见表2。LDR反应体系: PCR产物3 μl，10×Taq DNA ligase buffer 1 μl，Taq DNA ligase (40 U/μl) 0.125 μl，探针(10p) 0.01 μl/条，加H2O补至10 μl。LDR反应条件: 94℃30 s，56℃3 min，进行30个循环。取1 μl延伸产物，加8 μl上样loading，95℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪。

1.3统计学方法以Hardy-Weinberg平衡法检测各组基因频率的群体代表性。应用SPSS17.0软件进行正态性检验、方差分析和χ2检验。

2　结果

2.1基因分型检测结果多重PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检验结果见图1。多重LDR结果见图2。

表2　LDR反应探针序列

图1　PCR产物的凝胶电泳结果

图2　基因分型的多重LDR峰图

2.2基因型频率和等位基因频率分析

2.2.1SLC30A8(rs13266634)两组中CC、CT、TT基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM组CC、CT、TT基因型频率分别为38.9％、48.7％、12.4％，对照组分别为33.6％、51.4％、15％，差异无统计学意义(χ2= 0.770 3，P = 0.68)。T2DM组C和T等位基因频率分别为63.3％和36.7％，对照组分别为59.3％和40.7％，差异无统计学意义(OR =1.180 2，95％CI=0.803 8～1.733 0，χ2=0.715 5，P=0.39)。

2.2.2CDKN2A/2B(rs10811661)两组中TT、CT、CC基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM组TT、CT、CC基因型频率分别为31％、47.8％、21.2％，NC组分别为29.9％、50.5％、19.6％，差异无统计学意义(χ2= 0.170 8，P = 0.91)。T2DM组T和C等位基因频率分别为54.9％和45.1％，对照组分别为55.1％和44.9％，差异无统计学意义(OR =1.011 1，95％CI=0.694 4～1.472 3，χ2=0.003 3，P=0.95)。

2.2.3HHEX(rs1111875)两组中GG、GA、AA基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM组GG、GA、AA基因型频率分别为9.7％、45.2％、45.1％，对照组GG、GA、AA基因型频率分别为5.6％、44.9％、49.5％，差异无统计学意义(χ2= 1.035 6，P= 0.59)。T2DM组G和A等位基因频率分别为32.3％和67.7％，对照组G和A等位基因频率分别为28％和72％，差异无统计学意义(OR=0.833 3，95％CI=0.553 6 ～1.254，χ2=0.764 2，P=0.38)。

2.2.4TCF7L2(rs7903146)两组中TT、CT、CC基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM组TT、CT、CC基因型频率分别为0％、6.2％、93.8％，对照组分别为0％、1.9％、98.1％，差异无统计学意义(χ2= 2.620 8，P = 0.27)。T2DM组T和C等位基因频率分别为3.1％和96.9％，对照组分别为1％和99％，差异无统计学意义(OR= 0.295 1，95％CI= 0.060 6～1.437 0，χ2=2.566 1，P=0.11)。

2.3糖尿病组不同基因型人体测量学及代谢指标的比较

2.3.1SLC30A8(rs13266634) CC、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于TT基因型(P＜0.05)，TC、TG均高于TT基因型(P＜0.05)，CC基因型的FPG高于TT基因型(P＜0.05)。CC、 CT、TT基因型合并心血管并发症的构成比分别为61.4％(27/ 17)、45.5％(25/30)、21.4％(3/11)，三组基因型间的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

2.3.2CDKN2A/2B(rs10811661) TT、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于CC基因型(P＜0.05)，FPG、HbA1c、TC均高于CC基因型(P＜0.05)，TT基因型的TG高于CC基因型(P＜0.05)。CC、CT、TT基因型合并微血管并发症的构成比分别为29.9％(7/17)、44.4％(24/30)、62.9％(22/13)，三组基因型间的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

2.3.3HHEX(rs1111875) GG、GA基因型的FINS、HOMA-B均低于AA基因型(P＜0.01)，FPG、TC、TG均高于AA基因型，GG基因组的LDL-C高于AA基因组(P＜0.05)。GG、GA、AA基因型合并心血管并发症的构成比分别为72.7％(8/3)、49％ (25/26)、31.4％(16/35)，三组基因型间的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

2.3.4TCF7L2(rs7903146)糖尿病组各基因型间的代谢指标差异无统计学意义(P＞0.05)，并发症的构成比无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3　T2DM组临床变量与基因型的关系(±s)

表3　T2DM组临床变量与基因型的关系(±s)

与TT基因型比较: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;与CC基因型比较: 3) P＜0.05，4) P＜0.01;与AA基因型比较: 5) P＜0.05，6) P＜0.01; BMI:体重指数; HbA1c:糖化血红蛋白; TC:总胆固醇; TG:甘油三酯; HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇; LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇; FINS:空腹胰岛素

指标　SLC30A8(rs13266634)CDKN2A/2B(rs10811661) CC　CT　TT　TT　CT　CC年龄(岁)　51.48±12.13　 51.71±12.22　 57.14±7.7　 52.83±10.8　 51.02±11.1　 54.38±12.3 BMI(kg/m2)　25.48±3.24　 25.35±3.46　 26.87±2.38　 24.77±2.54　 26.02±3.81　 25.77±2.74 FPG(mmol/L)　9.91±2.711)　9.16±2.14　 8.12±1.23　 9.66±2.993)　9.61±2.183)　8.15±0.99 HbA1c(％)　8.70±1.77　 8.39±1.45　 7.85±1.75　 8.65±1.73　 8.62±1.61　 7.73±1.36 TC(mmol/L)　5.59±1.482)　5.44±1.071)　4.49±0.92　 5.49±1.234)　5.66±1.313)　4.59±0.87 TG(mmol/L)　2.83±1.481)　2.56±1.272)　1.52±0.30　 2.91±1.624)　2.59±1.273)　1.86±0.60 HDL-C(mmol/L)　1.13±0.31　 1.20±0.34　 1.09±0.35　 1.18±0.32　 1.13±0.33　 1.19±0.36 LDL-C(mmol/L)　3.24±0.98　 3.32±0.94　 3.28±0.89　 3.35±1.04　 3.36±0.91　 3.02±0.86 FINS(mU/L)　1.47±0.401)　1.48±0.241)　1.69±0.26　 1.48±0.344)　1.46±0.293)　1.65±0.32 HOMA-IR　1.10±0.34　 1.08±0.23　 1.24±0.28　 1.09±0.29　 1.08±0.26　 1.20±0.32 HOMA-B　2.01±0.531)　2.06±0.341)　2.34±0.28　 2.04±0.494)　2.01±0.43)　2.29±0.33指标　HHEX(rs1111875)TCF7L2(rs7903146) GG　GA　AA　CT　CC年龄(岁)　47.7±6.53　52.21±11.7　53.27±11.5　55.29±11.2　52.09±11.3 BMI(kg/m2)　25.9±2.85　25.31±3.54　25.79±3.09　25.47±2.67　25.59±3.32 FPG(mmol/L)　10.59±2.826)　10.23±2.545)　8.13±1.31　8.10±1.38　9.40±2.38 HbA1c(％)　9.26±2.12　8.53±1.48　8.18±1.63　8.50±1.70　8.43±1.63 TC(mmol/L)　6.60±0.905)　5.68±1.355)　4.84±0.93　4.96±0.74　5.41±1.29 TG(mmol/L)　3.01±0.995)　2.92±1.326)　2.04±1.25　2.56±0.84　2.53±1.36 HDL-C(mmol/L)　1.26±0.31　1.15±0.33　1.15±0.34　1.03±0.29　1.17±0.33 LDL-C(mmol/L)　4.7±0.245)　3.16±0.83　3.14±0.92　2.88±0.64　3.31±0.96 FINS(mU/L)　1.33±0.16)　1.42±0.316)　1.62±0.32　1.56±0.46　1.50±0.31 HOMA-IR　0.99±0.1　1.07±0.25　1.18±0.33　1.11±0.45　1.11±0.28 HOMA-B　1.81±0.226)　1.93±0.456)　2.28±0.34　2.22±0.52　2.07±0.42

3　讨论

2007年，Nature报道了首个在法国人群的T2DM GWAS，发现SLC30A8、HHEX、EXT2和LOC387761与T2DM的发病风险关联，同时验证了TCF7L2与T2DM的相关性。随后冰岛人群研究成功验证了SLC30A8基因的rs13266634，同时发现了CDKAL1rs7756992，这两个位点在高加索人和中国香港人中均得到验证。同一时期，来自3个研究组DGI、WTCCC /UKT2D和FUSION的GWAS发表于同一期Science上，均成功验证了TCF7L2、KCNJ11、PPARγ、SLC30A8和HHEX区域，还发现了CDKAL1、IGF2BP2和CDKN2A/B〔1～5〕。Wu等〔6〕研究得出CDKAL1，CDKN2A/B，IGF2BP2，SLC30A8基因变异与T2DM发病关，HHEX变异与上海汉族人T2DM发病相关，与北京汉族人发病无关，HHEX基因在北方人群的结果与本研究结果一致。中国香港〔7〕、台湾〔8〕汉族人研究显示，TCF7L2基因的rs7903146C/T多态性与T2DM无相关性。中国上海地区汉族人的研究结果提示SLC30A8 (rs13266634)、CDKN2A/2B (rs10811661)、HHEX(rs1111875)、TCF7L2(rs7903146)基因多态性与T2DM发病相关〔9〕，与本研究结果不一致。这可能由于本研究样本量较少导致抽样偏差以及地区种族的差异所致。

SCL30A8基因位于8号染色体(8q24)，编码一种在胰腺β细胞分泌囊泡中表达的锌转运体8。通过把锌转移至有胰岛素的囊泡中，来调节胰岛素的生物合成、稳定、储存〔10〕。结合文献SLC30A8(rs13266634)存在T→C的变异。本研究结果提示rs13266634的C等位基因可能与空腹胰岛素分泌不足，胰岛功能衰竭相关。Ingelsson等〔11〕也证实SCL30A8基因变异可增加空腹胰岛素原水平，其机制可能通过减少胰岛β细胞增殖或增加其凋亡来减少β细胞质量，从而使胰岛素原转化成胰岛素的分子过程受到损伤。本研究提示C等位基因可能增加心血管并发症的发病率。Sattar〔12〕在研究糖尿病与心血管疾病的关系中指出在校正了年龄、性别及其他脂质变量的模型中，TC和LDL-C水平增高对心血管疾病的预测价值更高。本研究C等位基因增加心血管并发症发病率的可能与CC、CT基因型的TC高于TT基因型有关。CDKN2A/2B基因位于9号染色体(9q21)，是一个已知的肿瘤抑制基因，其产物P16抑制细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)，而CDK4是一个有效的胰腺β细胞增殖调节剂，CDKN2A/2B基因过表达可导致胰腺发育不全和糖尿病。本研究提示T等位基因与胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌减少相关，与Wu等〔6〕的研究结果一致。另外TT基因型增加微血管并发症的发病率，而这是否与FPG、HbA1c高于CC基因型说明长期血糖控制不佳有关还需进一步深入的研究。基因是肝脏和胰腺发育的必须基因，是WNT信号通路作用的靶点。本研究提示G等位基因可能与T2DM心血管发病率相关。与Chen等〔13〕研究结果一致。同时，本研究还说明HHEX(rs1111875) G等位基因的TC和LDL-C增高可能是增加心血管风险的原因。

综上所述，SLC30A8 (rs13266634 )、CDKN2A/2B (rs10811661)、HHEX(rs1111875)、TCF7L2(rs7903146)未发现与中国东北汉族人群T2DM相关，不排除样本量较少以及种族地区差异造成的。SLC30A8基因多态性位点rs13266634、HHEX基因多态性位点rs1111875与T2DM心血管并发症存在一定的相关性，CDKN2A/2B基因多态性位点rs10811661与T2DM微血管并发症存在一定的相关性，还有待于进一步研究证实。

4　参考文献

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〔2015-03-15修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

·心脑血管及代谢性疾病·

通讯作者:刘桂锋(1980-)，男，博士，主治医师，主要从事疾病影像学诊断研究。

〔中图分类号〕R589.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 15-4201-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.040