食管鳞癌外周血循环肿瘤细胞检测及其临床意义

袁东红　王　芳　陈雪梅

作者单位：716000 陕西省延安大学附属医院(袁东红，王　芳)；638001 四川省广安市人民医院(陈雪梅)



食管鳞癌外周血循环肿瘤细胞检测及其临床意义

袁东红王芳陈雪梅

作者单位：716000 陕西省延安大学附属医院(袁东红，王芳)；638001 四川省广安市人民医院(陈雪梅)

【摘要】目的 探讨食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞数量与食管癌病理生理特征之间的相关性。方法采用负性筛选策略，用红细胞裂解液和Mitenyi免疫磁珠分步分别去除食管鳞癌患者外周血样本中红细胞和白细胞，富集上皮来源的稀有细胞，免疫荧光染色法鉴定循环肿瘤细胞。分析术前循环肿瘤细胞检出阳性水平与临床各病理生理参数的相关性。结果食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞的检出阳性水平与患者肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移状态(N分期)、p-TNM分期、原发性肿瘤侵犯程度(T分期)显著相关(P<0.05)；与患者的年龄、肿瘤位置无密切相关(P>0.05)。结论食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞的检出数量可以反映肿瘤的生物学恶化程度，可作为临床治疗及预后判断的重要参考指标。

【关键词】食管鳞癌；循环肿瘤细胞；负性筛选

(ThePracticalJournalofCancer，2015，30：494～496)

食管癌(carcinoma of esophagus)是一种常见消化道恶性肿瘤疾病，发病率较高，其中鳞状细胞癌是主要的病理类型。该病以手术治疗为主，5年生存率只有30%左右，预后较差，究其原因主要是肿瘤的转移和复发[1]。血液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是食管癌术后复发、转移、影响预后的首要条件，因此，检测循环肿瘤细胞对早期发现肿瘤的微转移、判断食管癌的术后复发、评估疗效及指导临床治疗具有重要意义[2]。本研究采用基于细胞学水平的CTCs负性筛选策略的免疫荧光染色技术，检测食管鳞癌患者外周血中的CTCs，并分析食管鳞癌患者CTCs数量与其病理生理学特征的关系，从而探讨其检测的临床意义。

1材料与方法

1.1一般资料

选取我院2012年3月-2013年7月收治的46例食管鳞癌患者，其中男性36例，女性10例，年龄49～67岁，平均年龄(59.6±7.4)岁。纳入标准：①术前均经病理组织学明确诊断为食管鳞癌，且均为初治患者；②均未接受放化疗或其它抗癌治疗；③患者或家属签知情同意书。记录患者的肿瘤位置、分化程度、淋巴结转移状态(N分期)、p-TNM分期、原发性肿瘤侵犯程度(T分期)、术前CTCs数量。

1.2方法

于术前一天采集患者清晨空腹外周静脉血7.5 ml，室温保存，并在24 h内富集肿瘤细胞。将血液离心并去除上清后，加入红细胞裂解液，翻转孵育，离心后去上清，去除血液中的红细胞。再次离心去上清，所得细胞与Miltenyi免疫磁珠混合、孵育，再经特殊强磁场作用下的Ls柱去除白细胞，富集上皮来源的稀有细胞，用免疫荧光染色技术鉴定CTCs。经Mitineyi磁珠富集后，患者外周血可检出CK8/18/19角蛋白抗原阳性、CD45白细胞表面抗原阴性的上皮来源细胞，同时，可见CK8/18/19阴性/CD45阳性的白细胞。本研究以CTCs数量<3为检出阴性，CTCs数量≥3为检出阳性[3]。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件建立数据库分析数据，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1CTCs检出率

本组患者外周血经上述方法负性富集后，CTCs检出率为65.2%(30/46)，中位数为2，检出范围为0～70个。

2.2术前外周血CTCs的阳性水平与临床各病理生理参数的相关性

术前外周血CTCs的检出阳性水平与肿瘤细胞分化程度、N分期、p-TNM分期、T分期显著相关(P<0.05)；与患者的年龄、肿瘤位置无密切相关性(P>0.05)，见表1。

3讨论

食管癌5年生存率低的主要原因是肿瘤的转移和复发，而部分患者由于肿瘤分期较低，肿瘤转移证据往往不明显，因此采取一种有效的方法及时检测出癌细胞的播散或转移对患者意义重大[4]。目前常用的食管癌检测方法有影像学检查和肿瘤标志物检测。影像学检查一般只能发现晚期肿瘤，因此患者用这种方法检查出肿瘤时，往往已经失去了早期治疗的机会。肿瘤标志物检测如检测血液中的mRNA标志物、循环DNA标志物等，这种方法有助于早期发现肿瘤，其缺点是特异性较差，易出现假阳性结果[5]。CTCs是肿瘤转移和复发的首要条件，基于核酸的PCR技术能检测到食管癌患者外周血中的CTCs，但该方法易得到假阳性结果、无法观察到单个CTC细胞形态、无法估算样本中肿瘤细胞的数量，因此效果不佳。与PCR技术相比，近些年来基于细胞学的免疫富集方法，既可分离、计数肿瘤细胞，又可在细胞水平上进一步分析细胞的分子表型，是一种较理想的CTCs检测方法[6]。

表1　术前外周血CTCs检出阳性水平与临床各

本研究采用负性富集筛选策略的免疫荧光染色法，检测食管鳞癌患者外周血中的CTCs，结果显示这种方法分离、富集、鉴定CTCs的效果较理想，CTCs检出率为65.2%，与其它上皮来源的实体瘤CTCs检出率报道相近[7-9]。有研究表明食管癌患者外周血CTCs术前检出水平与肿瘤细胞的分化程度、N分期、p-TNM分期、T分期显著相关。本研究结果亦表明肿瘤细胞分化程度越低、N分期越高、T分期越高、p-TNM分期，外周血CTCs检出数量越高[10]。其中肿瘤细胞分化程度及p-TNM分期与CTCs检出水平的相关性，提示CTCs的检出数量可作为食管鳞癌恶化程度的指标，反映肿瘤的进展程度，有助于及早发现肿瘤、正确判断肿瘤的进展情况，使患者得到及时有效的治疗，延长生存期，改善患者的生命质量，并为治疗效果及预后提供重要参考。

总之，采用负性富集筛选策略检测食管鳞癌治疗后外周血CTCs有助于食管鳞癌的诊断、并能反映肿瘤的进展程度、评估疗效、指导治疗及判断预后。

参考文献

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[3]李军，王伟，乔媛媛，等.食管鳞癌患者围手术期外周血循环肿瘤细胞检测的临床意义〔J〕.医学临床研究，2012，29(6)：1027-1029.

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[10]何平，王伟，任传利，等.负性筛选策略与食管鳞癌循环肿瘤细胞检测〔J〕.癌症进展杂志，2008，6(4)：402-408.

(编辑：甘艳)

Detection of Circulating Tumor Cells in Peripheral Blood of Patients with Esophageal Squamous Cell Carcinoma and Its Clinical Significance

YUANDonghong，WANGFang，CHENXuemei.Yan’anUniversityAffiliatedHospital，Yan’an，716000

【Abstract】ObjectiveTo explore the number of circulating tumorceus(CTCs)in the peripheral blood of patients with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)，and its relationship with physiopathological characteristics of esophageal neoplasms.MethodsUsing negatives selection system，red blood cells(RBCs)and white blood cells(WBCs)were depleted by red blood cell lysis buffer(RCLB)and Mihenyi magnetic beads，and the rare cells were enriched.Immunofluorenee staining(IF)was adopted to identify CTCs.Relationship between positive level of CTCs in the peripheral blood of patients with ESCC before surgery and physiopathological characteristics were analyzed.ResultsPositive level of CTCs in the peripheral blood of patients with ESCC was closely related to cell differentiation grade，lymph node metastasis status(N staging)，P-TNM stages，and invasion of primary cancer(T staging)(P<0.05)；and it was not related to age and location of tumor(P>0.05).ConclusionThe number of CTCs in the peripheral blood of patients with ESCC shows the tumor biology degree of deterioration，and it maybe served as a tumor marker to evaluate the treatment and prognosis of esophageal cancer.

【Key words】Esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)；Cimulating tumor cells(CTCs)；Negative selection

(收稿日期2014-08-13修回日期 2014-12-02)

中图分类号：R735.1

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2015)04-0494-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.04.007

通讯作者：袁东红