骨形态发生蛋白4 对反应性星形胶质细胞增殖的影响

吴茉莉，李 萍，汪黎鸿，陈晓燕，孔庆友，程晓馨

(大连医科大学 基础医学院 细胞生物学教研室，辽宁 大连116044)

脱髓鞘是许多中枢神经系统疾病(损伤)如多发性硬化症、急性播散性脑脊髓炎、坏死出血性白质脑炎及脊髓损伤的重要病理特征［1］。研究认为，髓鞘再生依赖于内源性少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPC)向少突胶质细胞(形成髓鞘)的成熟分化［2］。而骨形态发生蛋白4(bone morphogenic protein 4，BMP4)是抑制OPC 成熟分化的重要因素之一［3］，且中枢神经系统脱髓鞘损伤后BMP4 呈高水平表达［4］。有研究报道，BMP4 水平的升高与损伤处反应性星形胶质细胞的高水平表达相关［4］;另一方面，损伤病灶周围的星形胶质细胞活化、增殖，形成胶质瘢痕，阻碍神经再生［5-6］;这些均是影响中枢神经系统损伤后再生修复的重要因素。有关BMP4 与反应性星形胶质细胞增殖之间关系的报道甚少。本实验利用源于成年SD 大鼠脊髓损伤原代培养的星形胶质细胞模型，探讨BMP4 与星形胶质细胞增殖的关系，以期寻找调节髓鞘再生及抑制胶质瘢痕形成的新途径。

1 材料和方法

1.1 材 料

成年雌性SD 大鼠(200 ～220 g)，由大连医科大学实验动物中心提供，NYU 脊髓损伤仪(美国)，倒置荧光显微镜(Leica，德国)。所有实验均通过了大连医科大学伦理委员会批准。

1.2 方 法

1.2.1 成年SD 大鼠星形胶质细胞的纯化及处理:采用腹腔内膜注射戊巴比妥钠(50 mg/kg BW)麻醉。于第9 胸椎水平(T9)对大鼠实施背侧椎板切除术暴露脊髓，借助NYU 脊髓损伤仪产生力度为150 kdyn 的脊髓钝性挫伤。损伤后的第7 天，长度为2 cm 的脊髓(含损伤脊髓部分)被解剖取出，于Hanks 平衡盐溶液(含10 mmol/L HEPES)中切成体积为1 mm3的碎块，然后在预先配制的酶溶液(Hanks 平衡盐溶液含10 mmol/L HEPES、0. 01%papain、0.1% trypsin 及0.01% DNase I)中37 ℃消化30 min，随后用等体积的含20% 胎牛血清的DMEM 培养液终止消化过程，用移液管轻柔吹打组织，用70 μm 的尼龙网过滤，离心4 min(1500 r/min)，弃上清，加入星形胶质细胞培养液(DMEM +10%FBS+1 ×N2)，轻柔吹打，制成细胞悬液(1 ×106)，接种于T75 培养瓶中，置入37 ℃、5%CO2的培养箱中。每2 天换液1 次，约10 ～14 d 后细胞汇合，将培养瓶置于振荡器(Thermo Scientific)上，37℃振荡过夜(275 r/min)，去除小胶质细胞、少突胶质前体细胞、少突胶质细胞及神经元［7］。培养瓶中的细胞经0.25%胰酶(含0.05% EDTA)消化，以4 ×104的细胞密度接种于多聚赖氨酸(PDL)包被的培养皿中，培养皿预先置入细胞片用于免疫荧光及细胞增殖情况的检测。通过对星形胶质细胞的标记分子波形蛋白(vimentin)染色以确定星形胶质细胞的纯度。

人重组骨形态发生蛋白4(BMP4，R＆D Systems Inc.，Minneapolis，USA)以0.1%乙酸作为溶剂制成浓度为10 mg/mL 的贮存液，使用前用培养液稀释至工作液浓度10 ng/mL;Noggin［8］(BMP4 拮抗剂，R＆D Systems Inc.，Minneapolis，USA)使用前用培养液稀释至工作液浓度100 ng/mL。实验分为4 组:(1)正常对照组，培养液正常培养;(2)BMP4 组:10 ng/mL BMP4 持续处理细胞48 h;(3)Noggin 组:100 ng/mL Noggin 持续处理细胞48 h;(4)BMP4 +Noggin 组:用100 ng/mL Noggin 处理细胞30 min 后加入10 ng/mL BMP4，两者共同处理细胞48 h。实验结束后取各实验组的细胞爬片，用4%的多聚甲醛固定，进行各项指标的免疫荧光染色。为了实验的可信性，每个实验重复至少3 次。

1.2.2 细胞增殖分析:将配制好的5 -溴脱氧尿嘧啶核苷(5 -bromodeoxyuridine，Brdu，Sigma 公司)液体加入细胞培养液中(终浓度为10 μmol/L)，各组细胞继续培养24 h［7］，收集细胞爬片，行抗Brdu 免疫荧光染色，对星形胶质细胞的增殖情况进行检测和分析。

1.2.3 免疫荧光:取4%多聚甲醛固定的细胞爬片，1 ×PBS 洗涤细胞3 次，用0.01% Triton X -100和羊血清室温封闭1 h，清除封闭液，加含抗BrdU(1∶200)或抗vimentin(鼠单克隆抗体)的一抗溶液，4 ℃过夜，1 ×PBS 清洗细胞3 次，加入相应的荧光标记二抗(1∶200，Jackson ImmunoResearch)，37 ℃避光孵育1 h，用DAPI(蓝色荧光)染细胞核;1 ×PBS洗涤细胞3 次，防荧光淬灭的封片剂封片，在荧光显微镜下进行观察、计数及拍照。在10 ×物镜下，任意选取10 个视野，计算Brdu 阳性细胞占星形胶质细胞的百分比。

1.3 统计学方法

采用Prism 5.0 统计软件进行单因素方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

经过分离、纯化和培养，98%以上的细胞为vimentin 阳性细胞(星形胶质细胞的标记分子，见图1)。

免疫荧光的结果显示，各实验组中Brdu 阳性细胞占星形胶质细胞的平均百分比分别为:正常对照组3.10%，Noggin 组3.13%，BMP4 组14.03%，BMP4 +Noggin 组3.81%。与正常对照相比较，BMP4 组的Brdu 阳性细胞明显增多(P ＜0.01)。与BMP4 组相比，BMP4+Noggin 组的Brdu 阳性细胞明显减少(P ＜0.01)。见图1和图2。

3 讨 论

图1 各实验组星形胶质细胞中vimentin 和Brdu 的免疫荧光染色Fig 1 Immunofluorescent stainings of vimentin and Brdu in cultured astrocytes of different groups

图2 BMP4 对星形胶质细胞增殖的影响Fig 2 The effects of BMP4 on cell proliferation in cultured astrocytes

在中枢神经系统的脱髓鞘疾病中，轴突因表面髓鞘丧失而容易发生变性，而髓鞘再生可使受损的轴突免于进一步变性［9］。有研究显示髓鞘再生需要OPC 向产生髓鞘的成熟少突胶质细胞方向分化［2］。在病理状态下，脱髓鞘损伤处虽然存在少突胶质前体细胞，但这些细胞常常处于未分化状态，无法向少突胶质细胞方向分化［10］。因此，促进少突胶质前体细胞的成熟分化是髓鞘再生的理想策略之一。近年来，越来越多的研究表明，BMP4 是抑制少突胶质前体细胞成熟分化的重要因素，在脊髓脱髓鞘损伤过程中，BMP4 的表达水平升高且与临床疾病的严重程度呈正相关［3-4］。有研究报道BMP4 水平的升高与损伤处活化增殖的星形胶质细胞的分泌相关［4］。本研究利用成年SD 大鼠脊髓损伤原代培养的星形胶质细胞模型发现，活化增殖的星形胶质细胞不仅可分泌BMP4，而且BMP4 还可有效地促进反应性星形胶质细胞的增殖，表明BMP4 与星形胶质细胞增殖之间呈正反馈的关系。鉴于BMP4 与星形胶质细胞在髓鞘病理性损伤中的重要作用，BMP4 有望成为神经退行性疾病及脊髓损伤的潜在治疗靶点。另一方面，胶质瘢痕被认为是脊髓损伤后轴突再生和功能恢复的主要障碍［5-6］。本实验发现BMP4 的拮抗剂——Noggin 可有效地抑制BMP4 对反应性星形胶质细胞的促增殖作用，因此，降低BMP4 的水平或BMP4 的抑制剂也可能成为未来抑制胶质瘢痕形成，从而促进髓鞘再生的新的研究方向。

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