R(+)普拉克索对急性脑缺血大鼠脑损伤的保护作用

郭淑娟，王琮民

(1.邯郸市中心医院 老年病科，河北 邯郸056001;2.河北工程大学附属医院 神经内科，河北 邯郸056001)

脑卒中一般分为缺血性和出血性两种，缺血性脑卒中约占75%，是致残和致死率高、治疗难的一种神经系统疾病。其发病机制一般认为是由于缺血缺氧诱发的兴奋氨基酸毒性的释放和细胞内钙超载，使肌体清除氧自由基(ROS)能力下降，氧自由基大量增加最终导致氧化应激损伤［1］。因此，及早阻断或清除多余的ROS 可以减轻缺血后脑损伤。

普拉克索(PPX)分S-PPX 和R+PPX 两种异构体，两者都有抑制ROS 产生的作用，属于线粒体靶向抗氧化剂，前者是治疗帕金森病的常用药，后者和多巴胺D2/D3 受体亲和性极低，一般不会产生多巴胺能不良反应［2］。已有报道指出，R+PPX 可抑制肌萎缩侧索硬化(ALS)的发展［3］，但其对缺血脑卒中损伤的研究鲜有报道。本实验利用线栓法制作中动脉栓塞(MCAO)模型，通过腹腔注射R+PPX，观察其在不同时间对各组脑梗死体积变化及大鼠脑中ROS 数量影响，为临床治疗缺血脑卒中提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验仪器及试剂:大鼠呼吸机(美国CWE公司)、DGD-300S 电脑双极电凝器(功率自动补偿型，铭志诚医疗公司)、TDA -8301H 温度显示调节仪、透射电镜(Olympus 公司)、BH-2 显微镜(日本Phillip 公司)、TTC(上海恒远生物科技有限公司)、R+PPX(天津大学科威公司)、新型荧光探针H2DCF-DA(Sigma 公司)。

1.1.2 实验动物分组及模型制备:成年雄性健康大鼠60 只，体重250 ～300 g，购于天津市实验动物研究所，清洁级，并在河北工程大学医学院动物实验室进行实验。实验室设备齐全，实验条件良好。采用抽签方法将60 只健康雄性大鼠均分为3 组:假手术(sham)组，中动脉栓塞(MCAO)组和R +PPX 注射中动脉栓塞(R +PPX +MCAO)组，每组20 只。再灌注分为两个时间点，8 h 和24 h，每次10 只。R+PPX+MCAO 组于MCAO 前30 min 腹腔注射R+PPX(1 mg/kg)，sham 和MCAO 组注射等量的生理盐水。

大鼠用10%水合氯醛过量麻醉，仰卧固定，颈部正中切口，逐层分离左侧颈总动脉(CCA)，颈内动脉(ICA)，颈外动脉(ECA)。用动脉夹夹闭左侧CCA 和ICA，在ECA 上剪一小口，注入肝素钠生理盐水，将准备好的尼龙栓线插入ECA，用手术线轻轻结扎，松开ICA 的动脉夹，尼龙线顺势插入ICA，至ICA 和ECA 交叉处，然后调整插入栓线角度，要保证栓线的头部进入ICA，然后缓慢向ICA 入颅方向移动栓线约18 mm 至大脑前动脉起始处，阻断大脑中动脉血液供应，MCAO 建模成功，记录MCAO时间，将栓线扎紧，移去CCA 动脉夹，并且缝合各层的皮肤组织，栓线应在切口外留2 cm，MCAO 2 h时，将栓线轻轻拉出，线栓头端退回ECA 处，再灌注完成。手术完毕可用庆大霉素注射液冲洗伤口，手术过程规范、无菌，此过程大鼠体温保持在(37 ±0.5)℃，心率和动脉压保持在正常范围内。

1.2 方 法

1.2.1 脑梗死体积计算［4］:缺血再灌注8 h 或24 h大鼠用水合氯醛(10%)过量麻醉，断头取脑，在-24 ℃冰箱中冷冻全脑30 min，从额极至枕极把大脑切成2 mm 厚度的冠状切片5 个层面，将切片置于2%TTC 染色液中，在37 ℃条件下，避光孵育20 min，将5 个切片顺序摆放在蓝色背景平板上，拍照，计算脑梗死体积百分比。脑梗死体积百分比=梗死体积÷全脑体积×100%。

1.2.2 H2DCF-DA 染色分析［5］:将TTC 染色后制作的脑组织冷冻切片各取第4 片连续冷冻再切片，切为20 μm 10 片，利用H2DCF -DA 进行染色，检测ROS 阳性表达，用专业图像分析软件NIS Element确定半暗带区H2DCF-DA 阳性细胞数和平均荧光强度，荧光强度平均值=总荧光强度值/H2DCF -DA 阳性细胞数。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 3 组大鼠MCAO 建模过程的生理指标检测值

建立大鼠中动脉栓塞模型过程中，3 组大鼠的心率、动脉压和肛温差异经单因素方差分析差异无显著性意义(P ＞0.05)，可以忽略手术对实验动物的影响。见表1。

表1 3 组大鼠在MCAO 建模过程的生理指标检测值Tab 1 The physiological parameters of three groups at different time (±s)

表1 3 组大鼠在MCAO 建模过程的生理指标检测值Tab 1 The physiological parameters of three groups at different time (±s)

组别 心率(次/min) 动脉压(mmHg) 肛温(℃)sham 组340.73 ±10.07 99.76 ±10.53 37.09 ±0.33 MCAO 组 345.04 ±9.45 99.34 ±9.96 36.85 ±0.53 R+PPX+MCAO 组342.72 ±11.31 98.93 ±10.02 36.95 ±0.34

2.2 3 组大鼠脑梗死体积比较

再灌注后8 h 和24 h，MCAO、R +PPX +MCAO两组与sham 组相比较，梗死体积明显增大(P ＜0.05)，再灌注后8 h，R +PPX +MCAO 组的梗死体积明显小于MCAO 组(P ＜0.05)，再灌注后24 h，MCAO、R+PPX +MCAO 两组的脑梗死体积无明显差异(P ＞0.05)，且MCAO、R +PPX +MCAO 两组的脑梗死体积均随时间的延长而增加。见表2。不同时间脑梗死情况见图1。

表2 3 组大鼠在不同时间脑梗死体积百分比Tab 2 The infract volume of three groups at different time(%)

图1 不同时间脑梗死体积Fig 1 The infract volume at different time

2.3 H2DCF-DA 监测大鼠脑内ROS 阳性细胞数目和荧光染色结果分析

荧光染色sham 组大鼠没有出现脑梗死，图像显示未出现缺血半暗带，无H2DCF - DA 染色。MCAO、R+PPX +MCAO 两组在两个时间点的半暗带区均出现H2DCF -DA 染色细胞，BH -2 显微镜下胞体为绿色，可清晰看到凸起，再灌注8 h 时，H2DCF-DA 染色细胞R +PPX +MCAO 组明显低于MCAO 组(P ＜0.05)，荧光色也较弱，但24 h 时，两组的H2DCF -DA 染色细胞数、荧光强度无明显差异(P ＞0.05)。见图2，表3、4。

表3 3 组大鼠在不同时间ROS 阳性细胞数Tab 3 ROS(+)cell numbers of three groups

表4 3 组大鼠在不同时间荧光强度Tab 4 Fluorescence intensity of three groups

3 讨 论

脑卒中时，体内会产生一些可以清除自由基的酶，这些酶可以对脑缺血损伤起到保护作用［6］。故增加体内的抗氧化剂可以抑制ROS 的产生从而保护脑组织。R(+)普拉克索(R +PPX)是普拉克索两种异构体其中之一，具有抗氧化作用，可以抑制线粒体ROS 的产生，而且与多巴胺D2/D3 受体具有较低的亲和性，可以避免体内的多巴胺能不良反应。已有报道指出，R+PPX 可以抑制肌萎缩侧索硬化，可使肌萎缩侧索硬化大鼠模型的生命延长［7］。R +PPX 容易突破血脑脊液屏障，其在脑中的浓度比其在血浆中的浓度高出5 倍［8］。本实验采用建模前30 min 给大鼠腹腔注射R +PPX 的方法观察其效果，实验数据表明，缺血再灌注8 h 时，R+PPX 干预组的脑梗死体积明显小于未干预组，血再灌注24 h时，R+PPX 干预组的脑梗死体积和未干预组的脑梗死体积差异不大，说明一次性注射R +PPX 对脑缺血损伤有保护作用，但保护作用持续时间短。

图2 不同时间荧光染色结果Fig 2 H2DCF-DA fluorescence staining results at different time

本实验采用H2DCF -DA 荧光法测定ROS，用专业图像分析软件NIS Element 确定半暗带区H2DCF-DA 阳性细胞数和平均荧光强度，实验数据表明，缺血再灌注8 h 时，R + PPX 干预组的H2DCF-DA 阳性细胞数和平均荧光强度明显低于未干预组，说明R +PPX 可以抑制脑缺血后脑组织内ROS 的生成，且ROS 和脑梗死体积降低的时间点同步，这一结果提示R + PPX 可能是通过清除ROS 而起到对缺血脑组织的保护作用的。再灌注24 h 时，R+PPX 干预组和未干预组的H2DCF-DA阳性细胞数和平均荧光强度差异不大，说明R +PPX 清除ROS 的时效性不强，这可能与用药的剂量、频率有关系，故以后可以观察不同剂量和多次用药时R+PPX 对缺血脑损伤的保护作用。

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