Fractalkine 对人外周血单个核细胞IL-8 表达的影响及缬沙坦的干预作用

2015-03-02张晓春金元哲

大连医科大学学报 2015年4期

张晓春，金元哲

(中国医科大学附属第四医院心血管内科，辽宁沈阳110032)

Fractalkine(FKN)是一种近年发现的CX3C 家族趋化因子，具有趋化活性。IL -8 是一种炎症因子，与动脉粥样硬化关系密切。而关于FKN 与IL-8 的关系，目前国内外研究较少。缬沙坦(Valsartan)已在临床广泛应用，除降压作用外还表现出抑制炎症反应的效应。本文主要研究FKN 对人血单个核细胞IL-8 表达的影响及蛋白激酶C(PKC)在其中的作用，并观察缬沙坦的干预作用。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

健康人外周新鲜抗凝血、Hank’s 液(USA，康宁)、优等胎牛血清(FBS)(Hyclone 公司)、青霉素及链霉素(华北制药厂)、淋巴细胞分离液(浓度1.077 g/mL)(天津，TBD 公司)、乙二胺四乙酸(EDTA，Promega 公司)、人IL -8 ELISA 检测试剂盒(武汉，USCN. Life Science Inc)、重组人Fractalkine(Sigma)、Ro31 -8220(Sigma)、Valsartan(Sigma)、RPMI1640 培养基(Gibco)，DMSO(Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 人外周血单个核细胞(PBMC)的分离及分组:无菌条件下，先用密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离PBMC，然后每孔将1 ×106个单个核细胞/0.2 mL/铺于96 孔细胞培养板中，将细胞随机分为5 组，每组2 个复孔。对空白照组将PBMC置于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育。FKN 组在PBMC 培养液中加FKN，终浓度1 μg/mL。Ro31 -8220(PKC 阻断剂)组在PBMC 培养液中加入Ro31 - 8220 (终浓度为250 μg/mL)。FKN +Ro31 -8220 组在PBMC 培养液中加入Ro31 -8220(终浓度为250 μg/mL)，作用2 h 后，加入FKN(终浓度为1 μg/mL)。FKN +缬沙坦组在PBMC 培养液中加入缬沙坦(终浓度为250 μg/mL)，作用2 h后，加入FKN(终浓度为1 μg/mL)。除对照组外，另4 组FKN 终浓度加至1 μg/mL 后，均置于37℃，5%CO2培养箱中孵育。

1.2.2 IL -8 含量的检测:收集各组单个核细胞的培养上清，在FKN 终浓度加至1 μg/mL 后于12 和24 h 用ELISA 法检测其IL-8 表达。

1.3 统计学方法

2 结果

细胞培养12 h 或24 h 后，单纯Ro31 -8220 组与空白对照组比较，IL -8 表达无明显差异(P ＞0.05)。FKN 刺激12 h 后，IL -8 表达较空白对照组均明显减少(P ＜0.05);应用Ro31 -8220 预刺激2 h 后，再加入FKN 孵育12 h 组，IL-8 表达较FKN组明显增加(P ＜0.05);应用缬沙坦预刺激2 h 后，再加入FKN 孵育12 h 组，IL-8 表达较FKN 组明显减少(P ＜0. 05)。在细胞培养24 h 后，上述各组IL-8亦表现出同样的变化。同时，细胞培养24 h各组IL-8 表达均较12 h 明显减少(P ＜0.05)。

表1 各组细胞培养12 h 和24 h 后IL-8 浓度Tab 1 Results of the IL-8 expression from each group cultured after 12 h and 24 h (n=3，pg/mL，±s)

1)与空白对照组比较，P ＜0.05;2)与FKN 组比较，P ＜0.05

组别12 h 24 h空白对照组992.81±109.73 90.37±2.74 FKN 组 747.15±109.511) 74.41±4.601)Ro31-8220 组 976.42±88.522) 85.23±2.842)FKN+Ro31-8220 组 2218.08±184.121)2) 78.34±6.791)2 FKN+缬沙坦组 61.34±4.561)2) 57.47±1.331)2

3 讨论

最近研究表明，动脉粥样硬化是一个炎症反应过程［1-2］，FKN 是近年发现的一种特殊的炎症趋化因子，具有趋化和粘附的双重作用，与冠状动脉粥样硬化的发生、发展密切相关［3-4］。IL -8 主要由单核巨噬细胞产生，通过趋化中性粒细胞引起炎症反应，影响动脉粥样硬化斑块的稳定性，导致心血管事件的发生［5-6］。

PKC 是一种细胞质酶，在未受刺激的细胞中，PKC 主要分布在细胞质中，呈非活性构象。一旦有第二信使的存在，PKC 将成为膜结合的酶，它能激活细胞质中的酶，参与生化反应的调控，同时也能作用于细胞核中的转录因子，参与基因表达的调控，是一种多功能的酶。研究表明，PKC 及其介导的信号通路与动脉粥样硬化的形成和发展密切相关［7］。

FKN 和IL -8 都可影响细胞内炎症因子的表达，但二者相互作用及引发的信号传导机制尚不明确。本组此前研究表明，趋化因子FKN 可能通过ERK、PI3K 信号途径抑制IL - 8 的表达，而通过NF-κB 途径促进IL -8 的表达［8］。那么，PKC 信号途径在FKN 抑制IL -8 表达中起着什么样的作用?本实验应用PKC 特异性抑制剂Ro31 -8220 阻断PKC 的作用，结果显示单纯Ro31 -8220 对IL-8的表达无明显影响，而经FKN 诱导后IL -8 的表达明显增加，说明FKN 可能通过PKC 途径抑制IL -8的表达。

有研究显示，缬沙坦(Valsartan)除降压作用外还表现出抑制炎症反应的效应［9］。根据本实验结果，缬沙坦在FKN 抑制IL-8 表达过程中起协同抑制作用，机制可能是缬沙坦抑制炎症因子的表达，从而进一步使IL-8 表达减少。

本研究证实FKN 可抑制人外周血单个核细胞IL-8 的表达，这一作用可能通过PKC 途径实现，缬沙坦可增强FKN 对IL -8 表达的抑制作用。探索FKN 与IL-8 的关系，研究FKN 引发的信号传导机制，有助于提高对免疫炎症因子复杂的错综网络关系的认识，指导临床实践;而Ang II 受体拮抗剂缬沙坦可抑制IL-8 的表达，为缬沙坦的抗动脉粥样硬化作用提供了依据。

［1］ Jaipersad AS，Lip GYH，Silverman S，et al.The role of monocytes in angiogenesis and atherosclerosis［J］. J Am Coll Cardiol，2014，63(1):1 -11.

［2］ Frostegärd J. Immunity，atherosclerosis and cardiovascular disease［J］.BMC Medicine，2013，11(1):117.

［3］ Ioannidis JP，Tzoulaki I.Minimal and null predictive effects for the most popular blood biomarkers of cardiovascular disease［J］.Circ Res，2012，110(5):658 -662.

［4］ Yao K，Lu H，Huang R，et al.Changes of dendritic cells and fractalkine in type 2 diabetic patients with unstable anginapectoris:a preliminary report［J］. Cardiovas Diabet，2011，10:50 -59.

［5］ Samnegard A，HultheJ，Silveira A，et al. Gender speciticassociationsbetween matrix metalloproteinases and inflammatory markers in post myocardial unfarction patients［J］.Atherosclerosis，2009，202(2):550 -556.

［6］ Beaudeux J，Giral P，Bruclert E，et al.Matrix metallorapeutic perspectires［J］. Clin Chem Lab Med，2004，42(2):121 -131.

［7］ Steinberg SF. Cardiac actions of protein kinase C isoforms［J］.Physiology:Bethesda，2012，27(3):130 -139.

［8］金元哲，雷明明，颜冰，等.趋化因子FKN 对人外周血单个核细胞IL-8 表达的影响及ERK、PI3K 和NF-κB 在其中的作用［J］.大连医科大学学报，2014，36(2):124 -128.

［9］ Yang J，Jiang H，Yang J，et al. Valsartan preconditioning protects against myocardial ischemia - reperfusion injury through TLR4/NF - κB signaling pathway［J］. Mol Cell Biochem，2009，330(1 -2):39 -46.