p53 -p21 通路在动脉血管平滑肌细胞衰老中的作用研究

蔺昕燕，贾玉红，郭连英，贾玉杰，徐婷婷

(1.大连医科大学附属第二医院 妇产科，辽宁大连116027;2.大连医科大学基础医学院病理生理学教研室，辽宁大连116044)

血管衰老是心血管疾病的主要危险因素之一［1］。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)作为构成血管壁最丰富的细胞群，位于大动脉内弹力膜下的血管中层，通过收缩功能调节血管管腔直径、机体血压以及全身的血流分布。VSMC 衰老与血管衰老及其相关血管疾病密切相关，衰老VSMC 相关的表型变化促进动脉内膜增厚，血管壁胶原纤维等细胞外基质沉积，血管壁动脉硬度随年龄增长极度增加从而导致动脉功能下降，这种衰老相关的血管重构使动脉粥样硬化等血管疾病易于发生［2］。

在正常人类细胞，p53 或者p21 基因失活可以延长细胞的复制性寿命，提示这条通路与细胞衰老有密切联系［3］。p53 介导了细胞对DNA 损伤反应，p53 既能介导由端粒缩短导致的复制性衰老，也能介导应激导致的早老，它的下游靶分子是p21。p21是cyclin 依赖的蛋白激酶的抑制剂，能抑制细胞周期，使细胞进入不可逆性生长停滞。p21 是广谱的细胞周期抑制剂，通过特异性抑制cyclinD1 -CDK4/CDK6、cyclinE -CDK2、cyclinA -CDK2 的蛋白激酶活性，既可导致G1期停滞也可以导致G2期停滞［4］。

本研究用Ang II 诱导血管平滑肌细胞衰老，观察衰老相关分子在VSMC 衰老中的变化，进一步通过敲除p53 及过表达p21 来研究p53 -p21 通路在VSMC 衰老中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

SMCM 血管平滑肌细胞专用培养基为Sciencell公司产品;DMEM 培养基为Gibco 公司产品;I 型胶原酶及弹性蛋白酶为Sigma 公司产品;Ang II 为Sigma 公司产品，货号为A9525。SA -β -Gal 检测试剂盒为Biovision 公司产品。抗体Anti -p53(santa cruz 公司)，Anti -p21(Millipore 公司)，Anti -GAPDH、Anti-p16 (Abcam 公司)。p53+/+及p53-/-鼠购自北京大学医学部实验动物中心，为C57BL/6 背景。实验所用腺病毒为根据大鼠p21 基因自行包装，取扩增第3 代以后使用。

1.2 实验方法

1.2.1 血管平滑肌细胞培养:VSMC 从SD 大鼠(雄性，8 周龄，180 ～200 g 左右)以及C57B/L 小鼠p53+/+及p53-/-(雄性，8 周龄，23 g 左右)胸主动脉分离得到。于无菌状态下速取胸主动脉，分离其脂肪层，置于消化液collagenase mixture(含I 型胶原酶1.5 mg/mL、弹性蛋白酶100 μg/mL、BSA 2 mg/mL)，在37 ℃孵箱中消化40 min 左右，取出，剥离外膜(完全去除外膜)，直剪纵向剪开血管，用棉棒破坏其内膜，取平滑肌层，剪碎，置于培养皿内，大鼠VSMC 采用含20%血清的DMEM 培养液，贴块法(37 ℃，5%CO2)培养，3 代以后换为10%血清培养基。实验用第5 代细胞。小鼠VSMC 采用含2%血清及1%平滑肌细胞生长因子添加物的Sciencecell培养液，37 ℃，5%CO2培养，静置5 d 后，再观察可见细胞团贴壁，周围爬出较多的VSMC。实验用第7代细胞。所有细胞需经形态学α-actin 免疫组化染色为阳性证明为VSMC。

1.2.2 衰老相关β 半乳糖苷酶染色:按试剂盒说明书操作，呈蓝色染色细胞为衰老细胞。

1.2.3 VSMC 的腺病毒感染:把最少量的培养液(以能覆盖细胞的体积为准)放入EP 管，加入终浓度为7 μg/μL 的多聚赖氨酸，混匀，室温放置5 min再加入适量病毒(p21 和GFP，分成低、中、高3 个剂量梯度)，混匀，室温放置100 min。将细胞用灭菌的PBS 洗2 遍后，加入上述病毒混和液，将细胞放入细胞培养箱，感染细胞120 min 后，加入新鲜的完全培养液至常量，感染24 h 后荧光显微镜观察95%以上细胞可见绿色荧光，则为成功感染。

1.2.4 Ang II 诱导血管平滑肌细胞衰老:在VSMC中加入含10-7mol/L Ang II 的含1%血清的维持培养基，持续作用5 d，培养基每天更换，对照组用相同体积的灭菌去离子水替代Ang II，5 d 后经SA-βgal 染色证明半数以上细胞发生衰老，即衰老诱导成功。

1.2.5 Western-blot 检测:细胞用预冷的PBS 洗2次，弃去PBS，加约为细胞5 倍体积的RIPA 裂解缓冲液裂解细胞，冰浴30 min。于4 ℃12000 r/min离心15 min。上清液即为细胞总蛋白。40 μg 蛋白经10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转到PVDF 膜上，与p53、p21、p16、GAPDH 抗体4 ℃孵育过夜，与相应的二抗室温孵育1.5 h，采用化学发光法检测。

1.2.6 细胞周期同步化:接种1 ×105/孔细胞至6孔板，细胞贴壁长至60%融合时，分别感染ad GFP与ad p21 24 h 后，血清饥饿24 h 使细胞同步化，即换成无血清的DMEM 培养液，24 h 后换为10%FBS的DMEM 培养液继续培养24 h 后收集细胞用于流式细胞仪测定(FCM)及Western-blot 检测。

1.2.7 流式细胞检测:用2 mmol/L EDTA 胰酶消化细胞后，PBS 洗2 次，取2 ×104个细胞-20 ℃预冷的70%酒精固定4 h 以上，染色前用PBS 洗2 次，在0. 2% TritonX - 100、0. 2% EDTA，0. 04 mg/mL RNase 中37 ℃处理30 min，然后加20 μg/mL 碘化丙啶(PI)染色，FCM 检测。

1.2.8 胸腺嘧啶掺入实验(3H-TdR):取对数生长期大鼠VSMC，接种于12 孔细胞培养板中分别感染ad GFP 与ad p21，感染12 h 后，换无血清的DMEM，同步化细胞24 h，向培养孔中加入含10%FBS 的培养液，孵育24 h，每组细胞取3 个孔，向每孔中加1 μCi 3H -TdR，弃上清液，用PBS 洗2 次后，加预冷的10%三氯乙酸(TCA)洗3 次，每次5 min。然后每孔加0.3 mL 0.3 mol/L NaOH，37 ℃处理30 min 或4 ℃裂解过夜，收集裂解液加于5 mL离心管中，加3 mL 闪烁液后，用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 Ang II 刺激后VSMC 内血管衰老相关基因表达的变化

VSMC 经Ang II(10-7mol/L)作用第0、2、3、5天后，p53、p21、p16 的蛋白表达呈时间依赖性增加，尤其以p53 及p21 增加幅度更为明显。见图1。

2.2 p53 基因敲除对Ang II 导致的小鼠VSMC 衰老的影响

Ang II 诱导后，经SA -β -gal 衰老染色显示，p53+/+VSMC 衰老细胞数明显增加，而p53-/-VSMC明显少于p53+/+VSMC(P ＜0.01)，见图2。

图1 Ang II 处理0、2、3、5 天后VSMC 蛋白表达的变化Fig 1 The expression of p53，p21，p16，GAPDH of VSMCs under Ang II administration

图2 p53 敲除鼠及其同窝野生鼠VSMC 经Ang II 处理后SA-β-gal 染色结果(SA-β-gal×100)Fig 2 Loss of p53 inhibit VSMC senescence induced by Ang II(SA-β-gal×100)

2.3 过表达p21 对VSMC 细胞周期停滞和衰老的影响

过表达p21 的VSMC 经过24 h 饥饿时细胞周期同步化，血清刺激后，3H -TdR 掺入量在感染腺病毒GFP 组显著增加，而感染腺病毒p21 组3H -TdR 掺入量明显低于ad GFP 组(P ＜0.01)。见图3。

图3 p21 过表达抑制3H-TdR 掺入Fig 3 Over-expression of p21 suppress VSMC proliferation induced by 10% FBS

在血清刺激0 h，80%以上的细胞处于G1期，在血清刺激24 h 处于G1期VSMC 的比例明显下降，与感染GFP 组比较，p21 过表达组明显抑制细胞周期从G1向S 期转化，使处于G1期的VSMC 的比例显著升高，并呈现p21 剂量依赖性的升高，中度过表达p21(P ＜0.05)，高度过表达p21(P ＜0.01)。见图4。

2.4 过表达p21 导致大鼠VSMC 衰老

在不加任何刺激情况下，培养到第5 天时，与GFP 组比较，p21 过表达的VSMC 发生显著衰老。见图5。

3 讨 论

本实验用Ang II 诱导VSMC 衰老，Ang II 在调节心血管结构和稳态方面发挥作用，既作为体内最强的血管收缩因子，也是细胞内的促有丝分裂信号因子。Ang II 信号通路激活对血管老化的发生和发展起重要作用，有研究表明老龄时动脉壁的Ang II表达增加［5］，并且与老龄大动脉壁的重构密切相关［6］。年轻大鼠长期应用Ang II 导致动脉中膜增厚和内膜VSMC 浸润，引起和老龄大鼠动脉相似的动脉壁血管重构变化［7］。强烈Ang II 信号激活及长时间的Ang II 处理能导致VSMC 的衰老。Ang II会引起两种类型的VSMC 衰老，分别是不伴端粒缩短的应激导致的早老和使端粒缩短加速的复制性衰老［8］。衰老相关分子p53，p21，p16，KiRas2A 是Ang II 引起衰老的下游执行者［9］。本研究也证明了Ang II 诱导VSMC 衰老后，衰老相关分子p53，p21，p16 呈时间依赖性增加，尤其以p53、p21 增加显著，提示p53 -p21 通路在Ang II 导致VSMC 衰老起重要作用。为了进一步研究p53 -p21 通路在Ang II导致VSMC 衰老中作用，本实验利用p53 敲除鼠及其同窝野生型鼠的VSMC，采用SA -β -gal 染色方法显示衰老的VSMC，结果表明p53 基因敲除明显降低VSMC 衰老。在p53 的下游基因中，有几种是与细胞周期停滞引起细胞衰老有关，其中p21 是p53 执行激活细胞衰老的下游靶基因已为人共识，除p21 之外，有研究表明血管内皮细胞PAI -I 也是执行衰老功能的p53 的下游靶基因［10］。BTG2 和GADD45a 是复制性衰老起作用的p53 的下游。这些p53 的下游执行不同的功能防止细胞不受控制的生长和因基因组不稳定性导致肿瘤形成［11］。为了进一步探究p21 在VSMC 衰老中所起的作用，本研究在VSMC 中单独过表达p21，不用Ang II 等导致衰老因素的刺激就能引起VSMC 衰老，说明p21 是引起VSMC 衰老的重要执行者。本研究也检测了衰老相关分子p16 的表达，发现p16 的增加不如p21明显，并且在Ang II 作用晚期才出现明显增加。文献报道在血管平滑肌细胞的细胞周期停滞中作用较强的是p27 和p21，有研究表明在VSMC 内过表达p21 或p27 导致完全的细胞周期阻滞，而过表达p16出现部分细胞的G1期阻滞。这是因为过表达p21或p27 失活CDK2 和CDK4 导致G1期阻滞，p16 只抑制CDK4，但是对CDK2 没有明显抑制作用，因此不能将VSMC 完全阻滞在G1期［12］。

综上所述，本研究结果显示p53 -p21 通路是参与VSMC 衰老的重要通路。也提示了如果药物或者某些治疗能抑制p53 -p21 通路尤其是抑制p21 表达可能延缓VSMC 衰老，因为VSMC 衰老引起动脉功能减退及引起衰老相关血管疾病，因此，抑制VSMC 的p21 表达可能对延缓动脉衰老和预防及治疗衰老相关血管疾病方面起作用。

图4 过表达p21 引起VSMC 细胞周期G1 期阻滞Fig 4 Over-expression of p21 cause VSMC G1 phase block in a dose dependent manner

图5 过表达p21 导致VSMC 衰老 (SA-β-gal×100)Fig 5 Over-expression of p21 induce VSMCs senescence (SA-β-gal×100)

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