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14,15-EET通过TRPV4-SKCa复合物调节气管平滑肌收缩机制研究

2015-03-02桑大成丁圣刚

安徽医科大学学报 2015年5期
关键词:卡巴胆碱复合物

张 洁,沈 兵,桑大成,杜 鹃,丁圣刚

14,15-EET通过TRPV4-SKCa复合物调节气管平滑肌收缩机制研究

张 洁1,沈 兵1,桑大成1,杜 鹃1,丁圣刚2

摘要目的 探讨花生四烯酸细胞色素P450(CYP)表氧化酶代谢产物14,15-环氧化二十碳三烯酸(14,15-EET)对小鼠气管平滑肌收缩功能的影响及其机制。方法 采用离体气管实验,通过运用特异性钙激活钾通道阻断剂和瞬时受体电位离子通道4(TRPV4)通道阻断剂,观察14,15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的影响;采用免疫共沉淀实验检测TRPV4通道蛋白与小电导钙激活钾通道(SKCa)蛋白在小鼠气管平滑肌组织中的相互作用。结果 与对照组相比,300 nmol/L 14,15-EET预处理小鼠气管后,卡巴胆碱引起的收缩显著减弱;大、中电导钙激活钾通道阻断剂IbTX和TRAM34没有显著影响14,15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制效应;而SKCa阻断剂Apamin和TRPV4通道阻断剂RN-1734都分别显著阻断了14,15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制作用。免疫共沉淀结果显示TRPV4通道蛋白和SKCa通道蛋白可以彼此相互共沉淀。结论 在小鼠气管平滑肌中,14,15-EET通过TPRV4-SKCa钙信号复合物调节气管平滑肌的收缩。

关键词钙激活钾通道;瞬时受体电位离子通道4;14,15-EET;气管平滑肌

2015-02-02接收

作者单位:1安徽医科大学基础医学院生理学教研室,合肥 230032

2安徽医科大学第一附属医院儿科,合肥 230022

支气管哮喘是由多种炎症因子参与的慢性气道炎症,因其患病率和死亡率的逐年上升,已成为严重威胁公众健康的一种主要慢性病。环氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid,EETs)作为花生四烯酸的衍生物,可以使气管平滑肌舒张并减弱气管平滑肌细胞对Ca2+的敏感性[1],但其作用靶点还未完全阐明。该研究通过阐明EETs同分异构体中14,15-EET对激动剂引起的气管平滑肌收缩的作用及其机制,揭示气管平滑肌中瞬时受体电位离子通道4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)与小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+-channel,SKCa)所形成的钙信号复合物在调节气管张力中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 14,15-EET购自英国Abcam Biochemicals公司;卡巴胆碱、RN-1734、TRAM34、Apamin等均购自美国Sigma公司;TRPV4、SKCa抗体购自美国Santa Cruz公司;二抗Goat-Anti-Rabbit IgG购自合肥志宏生物有限公司;Protein A Magnetic Beads购自美国Millipore公司;克氏液(NaCl 118 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L、NaHCO325.2 mmol/L和glucose 11.1 mmol/L);高钾溶液(NaCl 58 mmol/L、KCl 60 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L、NaHCO325.2 mmol/L和glucose 11.1 mmol/L)。

1.1.2 实验动物 昆明种雄性小鼠,清洁级,6周龄,20~25 g,由安徽医科大学实验动物中心提供。正常进食饮水,室温维持(22±1)℃。

1.2 方法

1.2.1 气管环的制备 用CO2窒息法处死小鼠,迅速取出喉部以下的主支气管,放入备好的克氏(K-H)液并通有混合气体(95%O2和5%CO2)保持pH在7.40±0.05。在解剖显微镜下用精密手术剪和手术镊快速、轻柔地去除气管外周结缔组织,用粗糙的金属丝小心去除气管内皮,然后沿纵轴将气管剪成长约2 mm气管环。

1.2.2 离体气管张力实验 参照朱金行等[2]的实验方法,将分离干净的气管环悬挂于张力换能器上,并置于含有5 ml K-H液的浴槽内,通入含95%O2和5%CO2的混合气体;调节张力换能器,给予气管环500 mg前负荷,运用BL-420S生物机能实验系统检测气管张力信号,在K-H液中平衡40~60 min,且每隔15 min更换一次K-H液,待气管张力基线趋于稳定后,加入60 mmol/L的高钾溶液激动气管,收缩达峰值后,用K-H液洗3 min×4次,反复激动2

次后分两组,一组为对照组不做任何处理,另一组加入300 nmol/L 14,15-EET作为实验组;重复上述相同处理方法后分组,一组加入300 nmol/L 14,15-EET作为对照组,另一组加入IbTX阻断剂和300 nmol/L 14,15-EET预处理10 min(TRAM34、Apamin、RN-1734阻断剂方法同IbTX),然后加入不同浓度的卡巴胆碱,观察量效关系。

1.2.3 免疫共沉淀 从小鼠气管组织中提取蛋白进行免疫共沉淀实验。新鲜离体气管去掉脂肪、结缔组织,称重后加入适当体积的裂解液,冰上研磨裂解转入1.5 ml EP管中,置于冰上30~60 min,4℃、3 000 r/min离心5 min后取上清液。两个样品中分别加入抗TRPV4的抗体和抗SKCa抗体(抗SK3)进行免疫沉淀,4℃震荡2 h后分别加入预处理好的50 μl Protein A Magnetic Beads过夜;次日,于冰盒磁力架上吸附后弃上清液。清洗沉淀3次后加入50 μl 5×上样缓冲液煮沸,收集上清液后进行Western blot实验。

1.2.4 Western blot法 蛋白样品行SDS-PAGE电泳后以0.2 A恒流转膜,随后用5%脱脂牛奶封闭1 h,4℃孵育一抗过夜。次日,以PBST洗膜,5 min×3次,再加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1 h,PBST漂洗5 min×3次,显色。

2 结果

2.1 14,15-EET对小鼠气管张力的影响 卡巴胆碱可以浓度依赖地引起小鼠气管环收缩(10-10~10-3mol/L),与对照组相比,300 nmol/L 14,15-EET预处理使卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩显著减弱(P<0.05),见图1。

2.2 3种Ca2+激活钾通道阻断剂对14,15-EET引起的气管舒张的影响 大、中电导钙激活钾通道阻断剂50 μmol/L IbTX和10 μmol/L TRAM 34没有显著影响300 nmol/L 14,15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制效应;而SKCa阻断剂1 μmol/L Apamin显著阻断了14,15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制作用(P<0.05),见图2。

2.3 TRPV4通道阻断剂对14,15-EET引起的气管舒张的影响 TRPV4通道阻断剂20 μmol/L RN-1734+14,15-EET处理组与14,15-EET组相比,明显减弱了14,15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制效应(P<0.05),见图3。

2.4 TRPV4蛋白和SKCa通道相互作用 将小鼠气管平滑肌组织裂解后,提取蛋白,上样分别为小鼠气管平滑肌裂解液、洗脱液、免疫共沉淀IP产物,实验结果显示,TRPV4蛋白和SKCa通道蛋白第三亚型SK3可以彼此相互共沉淀。见图4。

3 讨论

钙激活钾通道属于钾通道家族中的一个分支。根据其电导大小可分为大电导钙激活钾通道、中电导钙激活钾通道和SKCa通道。SKCa通道广泛存在于哺乳动物组织中,如平滑肌、骨骼肌、肾脏及内分泌细胞等[3]。TRPV4通道是瞬时受体电位离子通道家族(transient receptor potential,TRP)中香草素受体亚家族成员,属于非选择性阳离子通道,对Ca2+具有一定的通透性,在生物体许多组织、器官中均有表达,可以感受低渗引起的细胞膨胀、机体温度变化以及佛波醇酯衍生物、细胞内外Ca2+浓度、花生四烯酸等的理化刺激,参与调节体内渗透压、机械刺激、温度、血管张力以及气管平滑肌的收缩,维持机体内环境的稳定,对机体许多生理功能的正常完成有重要作用。

EETs有多种同分异构体,如5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET[4]。目前研究认为EETs有舒张血管、调节脏器局部血流和抗炎等多种功能[5-6],还可作为第二信使在某些细胞信号转导过程中发挥重要作用[7]。有研究[8]显示,EETs能直接激活内皮细胞中的TRPV4通道调节血管平滑肌张力。然而,EETs引起平滑肌舒张的分子机制尚不十分清楚。在大鼠肠系膜动脉内皮细胞中,TRPV4 和SKCa可以形成钙信号复合物,通过TRPV4调节SKCa开放并引起血管平滑肌细胞超极化,从而引起血管舒张[9]。

气管平滑肌的收缩效应在调节呼吸系统疾病中起着重要作用。EETs作为花生四烯酸的衍生物,在哺乳动物的肺部、心脏和内皮细胞中都有表达[6,10-11],在气管上皮细胞中被称为超极化因子起到舒张气管和抗炎的作用[6]。虽然EETs相关研究日益受到重视,但其对气管平滑肌功能的作用还未完全阐明。平滑肌的收缩是一个复杂的生理过程,有多种机制参与调节。有研究[9]报道在血管内皮细胞中,TRPV4-SKCa可形成钙信号复合物调节血管平滑肌的收缩。本研究中的免疫共沉淀实验结果显示,TRPV4和SKCa在气管平滑肌也可以形成钙信号复合物,而且气管张力实验表明,预先加入14,15-EET处理后比对照组对卡巴胆碱的收缩反应显著减弱,这是由于14,15-EET可以激活细胞膜上TRPV4通道,介导Ca2+内流,导致局部Ca2+浓度迅速升高,进而激活与其相互作用的SKCa通道产生外向钾电流并导致细胞膜超极化,反馈性抑制电压依赖钙通道,使Ca2+内流减少、细胞内Ca2+浓度降低,抑制气管平滑肌的收缩,最终引起气管舒张。因此,充分认识EETs对TRPV4-SKCa复合物在气管平滑肌细胞上

的作用机制对呼吸系统疾病的防治具有重要意义。

参考文献

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14,15-epoxyeicosatrienoic acid regulates airway smooth muscle contraction through TRPV4-SKCasignal complex

Zhang Jie,Shen Bing,Sang Dacheng,et al
(Dept of Physiology,College of Basic Medicine,Anhui Medical University,Hefei 230032)

AbstractObjective To provide a mechanistic insight into how 14,15-epoxyeicosatrienoic acid(14,15-EET)which is a product of cytochrome P450 epoxygenase regulates mouse airway smooth muscle contraction.Methods Isolated mouse tracheal tension was measured in vitro.Mouse tracheal rings were treated by Ca2+-activated K+channel blockers or transient receptor potential vanilloid 4(TRPV4)channel blocker.The changes of relaxation caused by 14,15-EET in tracheal rings were recorded after the tracheal rings were contracted by carbachol in concentration-dependent fashion.Co-immunoprecipitation was used to examine the physical interaction between TRPV4 and SKCain airway smooth muscle.Results Tracheal tension measurement showed that compared with the control group,carbachol-induced contraction in 300 nmol/L 14,15-EET pretreatment group was significantly reduced.BKCa and IKCa blockers did not affect the effect of 14,15-EET on carbachol-induced tracheal contraction.However,SKCaand TRPV4 blockers notably inhibited the effect of 14,15-EET on carbachol-induced tracheal contraction,respectively.Conclusion 14,15-EET regulates airway smooth muscle contraction via TRPV4-SKCasignal complex.

Key wordsCa2+-activated K+channel;transient receptor potential vanilloid 4;14,15-EET;airway smooth muscle

作者简介:张 洁,女,硕士研究生;沈 兵,男,副教授,硕士生导师,责任作者,E-mail:shenbing@anhui.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金(编号:81371284)

文献标志码A

文章编号1000-1492(2015)05-0565-04

中图分类号Q 412

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