鱼类烂鳃病病原柱状黄杆菌溶血素基因的初步研究

李 烨李 楠张晓林秦 婷聂 品

(1. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

鱼类烂鳃病病原柱状黄杆菌溶血素基因的初步研究

李 烨1,2李 楠1张晓林1秦 婷1聂 品1

(1. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)隶属于拟杆菌门、黄杆菌纲、黄杆菌目、黄杆菌科, 是重要的水生动物致病菌且呈世界性分布, 鱼类感染柱状黄杆菌以后会引发柱形病(Columnaris disease), 在我国又称烂鳃病[1]。鲑科(Salmonidae)、鲤科(Cyprinidae)、鲶科(Siluridae)等多科鱼类(几乎所有的淡水鱼类)都会感染柱形病[2]。患病鱼体会出现烂鳃、体表溃疡、组织坏死及鳍条腐烂等症状,死亡率可高达 100%, 全球每年因柱形病感染引起鱼类发病死亡所造成的经济损失极其严重[3]。

柱状黄杆菌的致病性与环境因素[4]、寄生虫感染或体表受损伤以及菌株自身毒力[5]等密切相关。研究报道, 柱状黄杆菌的毒力因子包括黏附因子[6]、硫酸软骨素酶[7]等。该菌能在添加5% (v/v)无菌羊血的琼脂平板上产生β溶血[8], 其产生的溶血素(Haemolysin)也是一类重要的毒力因子[9]。溶血素作为细菌致病的重要毒力因子, 在疾病的发病过程中起着不容忽视的作用[10], 但有关柱状黄杆菌溶血素及其作用机理的相关报道较少。本研究从已构建的柱状黄杆菌基因组注释中筛选到一个溶血素基因, 对其进行了克隆和表达, 为进一步研究溶血素的功能及柱状黄杆菌的致病机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种和质粒

柱状黄杆菌G4菌株由中国科学院水生生物研究所于1972年从患烂鳃病的草鱼体内分离并保存, 大肠杆菌(Escherichia coli) M15、Top10均由本实验室保存。质粒pQE30购于Novagen公司。

1.2 基因组DNA的提取

将实验室保存的柱状黄杆菌G4菌株接种于含有托普霉素100 µg/mL的Shieh培养基(5 g/L蛋白胨, 0.5 g/L 酵母粉, 0.0165 g/L CH3COONa·3H2O, 0.01 g/L BaCl2·2H2O, 0.1 g/L K2HPO4, 0.05 g/L KH2PO4, 0.3 g/L MgSO4·7H2O, 0.0067 g/L CaCl2·2H2O, 0.001 g/L FeSO4·7H2O, 0.05 g/L NaHCO3, pH 7.2)[11], 28℃ 150 r/min振荡培养至细菌对数生长期, 采用基因组提取试剂盒(Omega)提取细菌基因组DNA。

1.3 全菌蛋白和胞外蛋白样品的制备

取20 mL处于对数生长期的G4菌株的培养液, 6000 r/min离心10min收集菌体, 并用500 µL PBS重悬, 于-80℃保存备用。上清经0.22 µm滤膜过滤后, 用30 kD分子截留浓缩管(Millipore)浓缩, 4000×g离心浓缩至200 µL,于-80℃保存备用。

1.4 溶血素基因序列分析

根据本实验室构建的柱状黄杆菌基因组注释, 筛选到一个溶血素基因hly2031(GenBank: KJ856900.1)。采用BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行同源基因的搜索和蛋白序列保守结构域的分析, 通过Translate软件(http://web.expasy.org/translate/)进行开放阅读框的搜索、氨基酸序列的推断及蛋白分子量的预测。

1.5 溶血素基因的克隆及原核表达载体的构建

根据 hly2031序列信息设计特异性引物。正向引物hly2031F-BamHⅠ: 5′-CGCGGATCC ATGGGTTTAGTCAC TGCCAA-3′和反向引物hly2031R-PstⅠ: 5′-AAAACTGCA GTTTAGATTGTAGTTCATCAT-3′, 分别含有 BamH Ⅰ(GGATCC)和 PstⅠ(CTGCAG)酶切位点。以 G4基因组DNA为模板, PCR扩增溶血素基因hly2031。PCR反应程序: 95℃ 5min预变性; 95℃ 30s, 52℃ 30s, 72℃ 1min 40s, 35个循环; 72℃延伸10min, 16℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物, 回收并纯化目的片段。

采用限制性内切酶 BamHⅠ和 PstⅠ对目的片段和pQE30质粒分别进行双酶切, 酶切产物用T4DNA连接酶16℃连接过夜, 连接产物转化至大肠杆菌 M15感受态细胞, PCR筛选阳性克隆并测序鉴定有无移码或突变。

1.6 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE检测

将含有溶血素基因的阳性克隆菌液按1∶100的比例稀释于含有氨苄青霉素100 µg/mL的LB液体培养基中, 37℃200 r/min振荡培养至A600约0.5, 取出1 mL作为未诱导的阴性对照。加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L, 继续于16℃低速诱导过夜。取1 mL诱导表达菌液及未诱导对照菌液5000 r/min离心5min回收菌体沉淀。为了检测目的基因的表达形式, 取出诱导后的表达菌液4 mL, 离心收集菌体,用500 μL PBS缓冲液重悬, 超声破碎处理, 离心分别收集上清和沉淀, 并将获得的沉淀重悬于500 μL PBS。将以上获得的样品进行SDS-PAGE分析。

1.7 重组蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

根据以上SDS-PAGE分析结果, 用浓度为0.5 mmol/L IPTG诱导200 mL菌液大量表达重组蛋白。5000 r/min离心5min收集菌体, 用8 mL Binding Buffer重悬沉淀并经超声波处理, 4℃ 14000 r/min离心30min收集上清并经0.22 µm滤膜过滤。使用His·Bind树脂纯化蛋白, 详细步骤参考His·Tag融合蛋白纯化操作手册。

用以上纯化的重组蛋白对家兔进行如下免疫: 初次免疫用400 μL(约1 μg/μL) 腘蛋白样品多点注射兔 淋巴结及脚掌。2周以后加强免疫, 用300 μL(约1 μg/μL)蛋白样品多点注射于背部皮下及脚掌。4周以后再次加强免疫并于6周后动脉取血, 将分离的血清分装并保存于-80℃。

1.8 溶血活性检测

取10 µL诱导表达菌液滴加到含5% (v/v)无菌脱纤维绵羊血的固体LB平板, 37℃培养箱静置培养; 取500 µL诱导表达菌经超声破碎后的上清液滴加到5%(v/v)Shieh血平板, 28℃培养箱静置培养; 将5 µL纯化后的重组蛋白(约1 μg/μL)滴加到5% (v/v) Shieh血平板, 28℃培养箱静置培养。

1.9 Western blot检测

将-80℃冻存的细菌菌体、上清样品及纯化蛋白经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离, 电转移至硝酸纤维素膜上。5%的脱脂牛奶(溶于PBS缓冲液中)室温封闭1h, 加入2%脱脂奶粉(溶于PBST中)稀释的兔抗溶血素多克隆抗体室温孵育2h, 再加入2%脱脂奶粉(溶于PBST中)稀释的碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG抗体, 室温下孵育1h。以上各步骤间用PBST洗膜3次, 每次5min, 最后DAB显色。

2 结果

2.1 溶血素基因的克隆及序列分析

hly2031基因开放阅读框全长1812 bp, 编码603个氨基酸, 分子量69.4 kD, 理论等电点8.36。软件预测显示,在蛋白分子内没有糖基化位点, 没有信号肽, 无跨膜结构区。BLAST比对结果表明, 该基因与柱状黄杆菌ATCC49512溶血素(YP_004943259.1)有 99%的一致性和100%的相似性, 与嗜冷黄杆菌(Flavobacterum psychrophilum)假设的溶血素(YP_001295003.1)有 85%的一致性和92%的相似性。在实验室中同时构建了柱状黄杆菌G18菌株的基因组注释, 从中筛选到溶血素(G18GL000072),与G4菌株溶血素有100%的一致性和100%的相似性。

2.2 溶血素在大肠杆菌中的表达及溶血活性检测

将构建好的重组表达载体转入宿主表达菌 M15, 在IPTG浓度为0.5 mmol/L下16℃低速过夜诱导。表达产物经10% SDS-PAGE分析, 与未诱导菌相比, IPTG诱导菌在70 kD附近均有一条明显的蛋白条带, 与预期结果相符,说明诱导表达成功。将IPTG浓度为0.5 mmol/L的诱导菌超声破碎后收集上清和沉淀, 均可见大小约为70 kD的蛋白条带。以纯化的蛋白质作为免疫原制备了兔抗柱状黄杆菌溶血素的多克隆抗体。纯化蛋白经Western blot分析显示, 可检测到大小约为 70 kD的蛋白条带(图 1)。在 5% (v/v)无菌羊血平板上, 诱导表达菌、诱导表达菌经超声破碎后的上清液及重组蛋白的周围均没有观察到明显的溶血环。

2.3 溶血素在柱状黄杆菌中的表达

Western blot检测结果显示, 在柱状黄杆菌全菌蛋白和胞外蛋白中均能检测到大小约 70 kD目的条带(图 2),并且胞外蛋白表达量约占全菌蛋白表达量的64%。

3 讨论

在许多致病菌当中, 溶血素都作为重要的毒力因子参与细菌的致病过程。例如, 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)溶血素能裂解红细胞和其他多种哺乳动物细胞, 腹泻实验显示溶血素具有肠毒性, 在霍乱弧菌引起的胃肠炎发病过程中发挥着重要作用[12]。

图 1 重组蛋白的表达、纯化和Western blot检测Fig. 1 Expression and purification and western blot analysis of recombinant protein

图2 目的蛋白在G4菌株中的表达Fig. 2 Expression of the haemolysin protein in Flavobacterium columnare G4strain

根据基因的结构与功能特点将溶血素分为重复子毒素家族(Repeats in toxin family, RTX)[13]、硫醇活性胆固醇结合细胞溶素家族(Family of thiol-activated, cholesterolbinding toxins, CBTs)[14]、沙雷氏菌属(Serratia)溶血素家族[15]等。在基因的相互作用上, RTX家族溶血素依赖于一个由四个功能相关的基因构成的操纵子发挥作用[16]。黏质沙雷氏菌(Serratia marcesces)溶血素溶血活性的发挥依赖于两种蛋白的共同作用, 是由两个毗邻的相关基因共同控制的结果[15]。本研究筛选了柱状黄杆菌G4菌株的一个溶血素基因并对其进行序列分析, G4溶血素与柱状黄杆菌ATCC49512溶血素、嗜冷黄杆菌溶血素序列相似性都很高, 但在该溶血素序列中未发现上述溶血素家族的保守结构域, 在其上下游区域也未搜索到与溶血功能相关的基因存在, 分析该基因可能独立发挥作用或者和其他相关基因共同作用。

研究发现, 不同溶血素基因的体外表达模式具有一定的差异, 如鳗弧菌(Vibrio anguillarum)中有多个溶血素基因, 其中 vah5编码 585个氨基酸并表达一种大小为66 kD的溶血素蛋白, 且在大肠杆菌中能表达出具有溶血活性的VAH5蛋白, 表明其能单独发挥溶血功能[17]。嗜冷黄杆菌溶血素和 VAH5具有一定的相似性[18], 都具有两个与酰基转移酶相关的功能域。然而, 由于密码子使用偏好性不同等原因, 嗜冷黄杆菌溶血素基因及其他多种基因在大肠杆菌中无法以可溶形式表达或产生分子量偏小的蛋白产物, 但在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中能表达分子量正确的嗜冷黄杆菌溶血素蛋白且具有可溶性, 推断副溶血弧菌可能是一种替代表达载体[19]。为了进一步研究溶血素基因的体外表达模式, 本研究对柱状黄杆菌溶血素基因进行原核表达, 重组蛋白能以可溶形式表达在上清中。这为在大肠杆菌中表达柱状黄杆菌基因提供了一定的参考, 同时为后续深入研究重组蛋白活性奠定了基础。

溶血素是许多细菌的胞外产物, 如大肠杆菌 α-溶血素(HlyA)是通过I型分泌系统分泌的RTX蛋白, 能对红细胞、内皮细胞、单核细胞等多种类型的哺乳动物细胞产生毒素作用[10]。本研究在柱状黄杆菌全菌蛋白和胞外蛋白中经Western blot均能检测到大小约为70 kD的目的条带,证明该溶血素是一种分泌型蛋白, 与多数溶血素分泌后发挥作用的模式相同。但是, 在绵羊血血平板上并未检测到该重组蛋白的溶血活性。在嗜冷黄杆菌中发现, 细菌胞外蛋白与红细胞共同孵育后也没有溶血现象, 该溶血素可能无法独立发挥作用或者合成后位于细菌表面而不是分泌至胞外, 其溶血功能的发挥可能具有接触依赖性,可能依靠细菌细胞壁上的凝集素与红细胞膜上的唾液酸相结合促发后续溶血素蛋白的溶细胞过程[20]。研究报道,细菌凝集素在细胞裂解酶(例如溶血素)的溶细胞过程中起到协同作用, 凝集素与裂解酶形成一个大分子或者单独两个分子结合于细菌表面或者游离于细菌外[21]。因此,可以推论柱状黄杆菌的溶血素蛋白分泌至胞外后可能无法单独发挥溶血功能, 可能也需要细菌及其凝集素的参与, 这有待于进一步的研究证实。

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PRELIMINARY STUDY ON HAEMOLYSIN GENE IN FLAVOBACTERIUM COLUMNARE, THE PATHOGEN OF COLUMNARIS DISEASE OF FISH

LI Ye1,2, LI Nan1, ZHANG Xiao-Lin1, QIN Ting1and NIE Pin1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

柱状黄杆菌; 溶血素; 基因; 表达

Flavobacterium columnare; Haemolysin; Gene; Expression

S917.4

A

1000-3207(2015)03-0604-04

10.7541/2015.79

2014-05-09;

2014-11-29

国家重点基础研究发展计划项目(2009CB118703)资助

李烨(1989—), 女, 河北廊坊人; 硕士研究生; 主要从事鱼类病原微生物研究。E-mail: liye891212@163.com

聂品, E-mail: pinnie@ihb.ac.cn