高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定茶叶中高关注的25种农药残留

丁　琳

(厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心， 福建 厦门 361100)

高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定茶叶中高关注的25种农药残留

丁琳

(厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心， 福建 厦门 361100)

摘要:本文建立了茶叶中25种常用农药多残留同时检测的液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。样品以乙腈作为提取剂，经石墨化炭固相萃取小柱净化，采用phenomenex C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，2.6 μm，100 A)分离，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，以电喷雾电离(ESI)、多反应监测(MRM)模式检测，外标法定量。25种农药在5-200 μg/L范围内，线性相关系数均大于0.99，线性良好。分析目标物添加水平为0.01-0.10 mg/kg时，回收率范围为70%-116%,RSD范围为4.3%-10.8%,符合残留分析的要求。25种农药的定量下限(S/N>10)为0.01 mg/kg。该方法的提取效果好、净化较彻底，灵敏度满足国内外限量标准的要求，适合茶叶中常用农药残留的同时测定。

关键词:高效液相色谱-串联质谱； 茶叶； 农药残留

Determination of 25 highly attentive pesticide

中国是茶的发源地，具有几千年的产茶历史，其中茶叶生产面积和总产量均居世界第一位，年出口量居世界第二位。为了防治茶树的各种病虫害，化学农药在茶园中广泛使用。日本和欧盟作为我国茶叶的重要进口国，近年来制定了许多农药最大残留标准，并不断进行修订，农药残留限量非常苛刻。如欧盟2008年9月1日实施的农药残留限量法规(EC)No.149/2008中涉及茶叶的现行农残限量标准共392项(童小麟等，2009)，其中啶虫脒、吡虫啉、噻嗪酮、哒螨灵的最高残留限量(MRL)分别为0.1、0.05、0.05、0.05 mg/kg，而2013年4月16日修订的(EC)No.799/2011中，更将氟乐灵的MRL由0.1 mg/kg更改为0.05 mg/kg。另外日本的《肯定列表制度》中与茶叶相关的农药残留限量标准也有251种(谢争珍，2008)，其中氟虫腈、茚虫威、三唑磷的MRL分别为0.002、0.01、0.01 mg/kg。针对国内市场，我国2014年8月1日正式实施的GB 2763-2014《食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量》中涉及茶叶的农残限量标准也有28项。因此，建立一个快速、准确的农药多残留检测方法十分必要。

目前，国内外涉及以上几种常用农药的检测方法有气相色谱法(GC)(龚雪莲，2007；叶江雷等，2005)、高效液相色谱法(HPLC)(王孝辉等，2012；苏婷等，2011)、气相色谱-质谱法(GC-MS)(GB/T23204-2008；蒋俊树等，2009)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)(胡贝贞等，2012；贾伟等，2013；GB/T23205-2008)等。其中GC和HPLC的方法灵敏度较低，选择性差，不适用于多种农药残留痕量分析的要求； GC-MS和LC-MS由于难以完全阐明化合物的结构裂解信息，定性准确度方面尚有欠缺，容易产生假阳性结果；而LC-MS/MS因同时具有灵敏度高和选择性高的特点，适用于分析基质复杂，背景干扰严重的痕量化合物。本文依据目前我国茶叶农药的使用情况，以高度关注的农药项目为研究对像，研究建立了茶叶中25种常用农药的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(SPE-HPLC -MS/MS)检测技术，对提取和净化方法进行优化和评估，并应用于实际样品的分析检测。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

电喷雾串联四级杆质谱仪(API 4000 Q trap，美国Applied Biosystems 公司)配高效液相色谱仪(Agilent 1200，美国Agilent公司)；高速涡旋振荡仪(IKA MS3 basic，德国IKA公司)；离心机(Anke TDL-40B,上海安亭科学仪器厂)；氮吹仪(TurboVap LV，美国Zymark公司)；超纯水发生器(Milli-Q，美国Millipore公司)，ENVI-Carb石墨炭柱(0.5 g，6 mL，美国Supelco公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(纯度大于98%,德国Fluka公司)，实验室用水为超纯水。所检测的25种农药标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

标准溶液的配置：分别准确称适量的农药标准品，用乙腈配制成约100 mg/L的单一标准储备液，于-20 ℃冰箱中保存，根据实际需，用乙腈逐级稀释成相应浓度的混合标准工作液。

1.2样品处理

1.2.1提取称取1.0 g均匀的茶叶试样(经超离心研磨仪粉碎后过2.0 mm筛)于聚四氟乙烯离心管中，加入15 mL乙腈，振荡提取2 min，以4000 r/min离心2 min，取上层溶液于25 mL带刻度玻璃试管中，再加入10 mL乙腈重复提取一次，合并两次提取液，40 ℃氮吹浓缩至约2 mL。

1.2.2净化将ENVI-Carb小柱装在固相萃取装置上，先用3 mL乙腈预淋洗活化小柱，保持流速约为1 mL/min，将提取液过ENVI-Carb小柱，再用9 mL乙腈洗脱，收集所有流出物于15 mL玻璃试管中，于40 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(1:1，v/v)溶解残渣，过0.22μm微孔滤膜，滤液供LC-MS/MS分析。

1.3检测条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 柱(50 mm×2.1 mm,2.6 μm，100 A)；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：400 μL/min。梯度洗脱程序：0-0.1 min，90%A-20%A；0.1 min-4.0 min，保持20%A；4.0 min-4.1 min，20%A-90%A；4.1 min-9.0 min，保持90%A。

1.3.2质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；电喷雾电压：5500 V；离子源温度：550 ℃。各组分的质谱参数见表1。

表1　25种农药的质谱参数

注：其中*表示定量离子

2结果与讨论

2.1样品前处理方法的选择

2.1.1萃取条件的选择本文所检测的25种农药多属于弱极性或中等极性，常用的提取溶剂有甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等。本文分别采用甲醇、乙腈、丙酮-二氯甲烷(1:1，v/v)三种溶剂对茶叶中25种农药残留物提取效果进行比较。以不含农药残留的茶叶样品作为基质，进行测定低限水平的添加回收实验，每种溶剂做2个平行，记录两个结果的平均值，其中乙腈和丙酮-二氯甲烷(1:1，v/v)的提取效率较高，回收率均可达到70%以上，但丙酮-二氯甲烷(1:1，v/v)提取的杂质较乙腈多，丙酮与水互溶，不利于下一步的浓缩净化，且二氯甲烷毒性较大，不利人体健康和环保，故选择乙腈为本实验的提取溶剂。不同提取溶剂对4种代表性农药提取效果的比较如图1所示。

图1　不同提取溶剂对4种代表性农药提取效果的比较

2.1.2净化条件的选择茶叶样品经溶剂提取后，提取溶液中存在大量色素，故需净化以降低基体效应对检测带来的影响。本文比较了PSA、氨基、C18和石墨化炭黑固相萃取小柱对茶叶提取液的净化效果。通过添加回收率考察净化结果。其中经C18柱净化的样品回收率比未过柱的回收率略低，C18属于反相柱，可有效去除基质中的脂类等非极性有机物，而茶叶中这类有机物含量较低，故净化效果不明显，还易引起目标农药的损失。经PSA柱和氨基柱净化的样品回收率与未过柱的样品相当，但净化效果有限，提取液仍呈墨绿色，易造成仪器污染。而经石墨化炭柱净化的样品色素基本除去，提取液为透明淡黄色，且回收率较未经净化的样品普遍略有提高，谱图基线平稳。故本实验采用ENVI-Carb固相萃取小柱净化提取液。不同固相萃取柱对4种代表性农药净化效果的比较如图2所示。

图2　不同固相萃取柱对4种代表性农药净化效果的比较

图3　茶叶空白样品和25种农药混合标准溶液的总离子流(TIC)色谱图

图4　4种代表性农药标准品的多反应监测(MRM)色谱图

2.2检测条件的选择

根据待测物的化学结构，确定25种化合物均适合在ESI源的正离子模式下电离，依据电喷雾电离的机理，以利于化合物去质子化的乙腈为有机相。并在流动相中加入甲酸和乙酸铵考察目标化合物的响应值，实验发现加入乙酸铵目标化合物的响应值降低，而加入0.1%甲酸，有利于化合物在正离子模式下，有更好的离子化效率，可提高目标化合物的响应值，并改善峰形，故本实验采用0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相。图3为茶叶空白样品和25种农药混合标准溶液的总离子流(TIC)色谱图，图4为4种代表性农药标准品的多反应监测(MRM)色谱图。

2.3标准工作曲线与定量限

在确定的最佳仪器分析条件下，配制25种农药浓度依次为5.0、10、50、100、200 μg/L的系列混合标准溶液。以目标组分的峰面积(y)对相应的质量浓度(x，μg/L)绘制标准曲线。结果发现，其相关系数(r2)均大于0.99，25种农药质量浓度在5.0-200 μg/L范围内具有良好的线性关系。用本茶叶样品进行加标回收实验，以信噪比(S/N)≥10确定25种农药的定量下限均可达到0.01 mg/kg。

表2　25种农药的线性方程、相关系数、添加回收率和相对标准偏差(n=6)

2.4回收率与精密度

在阴性茶叶样品中添加不同浓度的25种农药的混合标准溶液，使样品中农药含量的浓度为10、50、100 μg/kg，进行加标回收实验，每个水平浓度下做6个平行样，结果表明目标分析物的回收率均在70%-116%范围内，变异系数在4.3%-10.8%之间。回收率与精密度均符合农药残留分析要求。25种农药的线性方程、相关系数、添加回收率和相对标准偏差见表2。

2.5实际应用

利用建立的分析方法，对100多个日常茶叶样品中的25种农药残留进行了检测。在相同仪器条件下，样品的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的保留时间一致；且样品中各组分监测离子对的丰度比与标准溶液中对应物质离子对的丰度比接近时，可判定样品中存在对应的被测物。其中检出率较高的农药残留包括哒螨灵(0.010-0.22 mg/kg)、噻嗪酮(0.013-0.062 mg/kg)、吡虫啉(0.010-0.14 mg/kg)、啶虫脒(0.021-0.52 mg//kg)及唑虫酰胺(0.025-0.30 mg/kg)。一个代表性阳性样的质谱图见图5。

图5　一个阳性样品的MRM图(检出物：唑虫酰胺)

3结论

本文建立了高效液相色谱-串联质谱法快速检测茶叶中25种农药残留的方法。采用乙腈提取，石墨化炭固相萃取小柱净化，在质谱正离子模式下9 min内完成分离检测，25种农药的检出限均能达到0.01 mg/kg。与其他仪器法比较，串联质谱法灵敏度高，准确性好，有效降低了由仪器检测所产生假阳性的可能，保证了定性和定量结果的可靠性，适用于茶叶这种复杂基体的检测。方法采用phenomenex 50 mm短柱，分析时间短，简单快捷，适用于大量样品的多残留快速筛查。综上，本文为茶叶多残留同时检测提供了一种切实可行的方法。

致谢：

本研究得到徐敦明研究员的大力支持和指导，特此致谢！

参考文献

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胡贝贞,蔡海江,宋伟华.2012.茶叶中氟虫腈等8种农药残留的液相色谱-串联质谱法测定及不确定度评定.色谱,30( 9):889-895.

蒋俊树, 赵彬,周莉.2009.气相色谱-质谱法测定茶叶中36种农药残留.食品科学,30(14):276-280.

贾玮,黄峻榕,凌云,冯峰,郑月明,储晓刚.2013.高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中290种农药残留组分.分析测试学报,32(1):9-22.

苏婷, 侯如燕,赵秀霞,钱晓三,杨婷婷.2011.茶叶、茶鲜叶及茶汤中啶虫脒残留的检测.食品与发酵工业,37(10):174-177.

童小麟,邹伟.2009.欧盟新的茶叶农残标准分析与对策研究.检验局检疫学刊,19(3):56-59.

王孝辉, 宛晓春,侯如燕.2012.茶叶中吡虫啉农药残留的液相色谱检测方法.茶叶科学,32(3):203-209.

谢争珍. 2008.中国输日茶叶贸易及影响因素研究.茶叶,34(4): 225-229.

叶江雷,弓振斌,沈爱斯.2005.茶叶中9种农药残留的毛细管气相色谱法测定.分析仪器,( 2): 20-23.

GB/T 23204-2008,茶叶中519种农药及相关化学品残留量的测定，气相色谱-质谱法.

GB/T 23205-2008,茶叶中448种农药及相关化学品残留量的测定，液相色谱-串联质谱法.

(责任编辑：陈晓雯)

丁琳.2015.高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定茶叶中高关注的25种农药残留.武夷科学，31：182-189.

residues in tea by high performance liquid

chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

Lin DING

(InspectionandQuarantineTechnologyCenter,XiamenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,

Xiamen,Fujian361100,China)

Abstract:A method was developed for the simultaneous determination of 25 pesticide residues in tea by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The sample was extracted with acetonitrile and cleaned-up with a Carb solid phase extraction (SPE) column. The analytes were separated on a phenomenex C18 column(50 mm×2.1 mm,2.6 μm,100 A)and eluted with the gradient solution of acetonitrile and 0.1% formic acid. The 25 pesticides were determined in the modes of electrospray ionization (ESI) and multiple reaction monitoring (MRM). The analytes were quantified by matrix-matched external standard method. The calibration curves of 25 pesticide residues were linear in the range of 5-200 μg/L with correlation coefficients higher than 0.99. The average recoveries ranged from70% to 116% with the relative standard deviations of 4.3%-10.8% at the spiked levels of 0.01-0.10 mg/kg for all compounds. The limits of quantitation (LOQs, S/N>10) for 25 pesticides were 0.01 mg/kg. The method developed is suitable for the conformation and quantification of the residual pesticides in tea.

Key words:high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; tea; pesticide residues

中图分类号:O657.63; TS272.7

文献标识码:A

文章编号：1001-4276-(2015)01-0182-08

作者简介:丁琳(1984-)，女，学士，工程师。研究方向：食品安全检测。Email： jszx-ta-dingl@xmciq.gov.cn。

收稿日期：2015-09-09; 发表日期：2015-10-31