成人肾病综合征患者肾小管megalin表达变化及其可能机制探讨

皇甫长梅，王丽姝，李尚妹，陶静莉，刘伟敬，刘华锋*

(1.暨南大学附属第一医院，广东 广州510630；2.广东医学院附属医院 肾脏疾病研究所，广东 湛江524001)

成人肾病综合征患者肾小管megalin表达变化及其可能机制探讨

皇甫长梅1，王丽姝2，李尚妹2，陶静莉2，刘伟敬2，刘华锋2*

(1.暨南大学附属第一医院，广东 广州510630；2.广东医学院附属医院 肾脏疾病研究所，广东 湛江524001)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0557)

megalin是肾小管上皮细胞内吞蛋白质的主要受体，主要分布在肾脏近端肾小管刷状缘[1,2]，与Cublin共同构成Megalin/Cublin受体复合体，介导滤入肾小管腔中蛋白质的重吸收[3-6]。已陆续有研究发现，某些人类肾脏疾病患者及动物肾病模型肾小管megalin表达异常[7-12]，例如遗传性疾病Dent氏病和Fanscon综合征患者肾组织megalin表达减少[7,8]，而慢性肾衰竭狗模型[11]以及糖尿病肾病大鼠模型肾组织[12]megalin表达也明显减少，这说明肾小管Megalm表达异常是多种肾脏病的表现之一。肾病综合征以肾小球滤过膜受损、大量血浆蛋白漏出和肾小管重吸收部分漏出蛋白以及临床上排泄蛋白尿为特征，这些患者的肾组织megalin表达是否发生变化，以及megalin表达与肾小球损伤程度和病理类型是否存在相关关系？至今罕见相关研究报道。在本研究中，本研究通过探讨不同病理肾病综合征患者肾小管megalin表达是否存在差异，以期进一步探讨肾病综合征患者蛋白尿形成和肾小管损伤的发生机制。

1资料与方法

1.1研究对象选取2010年5月至2012年10月期间在广东医学院附属医院肾内科住院诊断为原发性肾病综合征患者62例(男:41例，女：21例)。对照组肾组织11例，主要来自因肾肿瘤切除肾脏而且远离肿瘤的肾脏组织。(1)肾病综合征纳入标准：临床符合为“三高一低”诊断标准，其中必备条件包括：①24小时尿蛋白>3.5 g/d，②血浆白蛋白<30 g/L，并经肾穿刺活检明确病理类型。(2)排除标准：①年龄小于14岁，或超过70岁；②紫癜性肾炎、乙肝病毒相关性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、银屑病相关肾炎、类风湿性关节炎肾损害以及肿瘤相关性肾病等继发性肾病综合征；③合并严重感染、急性肾衰竭、栓塞以及合并严重心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病、急性湿疹等；④肾穿刺活检前3个月内曾用激素及免疫抑制剂治疗。

1.2实验方法

1.2.1标本采集与保存常规进行肾脏穿刺术取得肾病综合征患者肾脏组织，经固定脱水包埋后石蜡固定于-80℃冰箱中冻存。所有标本检测前均无反复冻融。

1.2.2血清、尿液生化指标测定应用全自动生化分析仪测定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)、胆固醇(CH)等；应用全自动血细胞分析仪测定血红蛋白(Hb)；24小时尿蛋白定量用磺基水杨酸法测定。

1.2.3肾组织megalin表达检测应用免疫组织化学方法检测肾小管刷状缘megalin的表达。兔抗人megalin多克隆抗体购于美国Sigma公司，DAB试剂盒购于武汉博士德公司，兔二步法检测试剂盒(PV-6003)购于北京中杉金桥生物公司。根据试剂商提供的说明书操作，简要如下：3 μm厚石蜡切片常规脱蜡至水，3%双氧水灭活内源性过氧化物酶活性，于0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中微波热修复抗原。用正常山羊血清封闭非特异性结合位点，滴加一抗(1∶50稀释)4℃孵育过夜。次晨PBS洗涤后加二抗(非生物素PV-6003)室温孵育60 min，PBS冲洗后滴加DAB显色，最后苏木素复染及中性树胶封片。各组标本随机取两例作阴性对照，染色方法同上，用PBS代替一抗。结果判定：细胞膜或胞浆出现棕黄色染色为阳性。人工计数法半定量分析megalin表达量，简要步骤如下：根据细胞刷状缘着色深度及阳性小管数分别记分为0～3 分，着色深度以多数细胞呈色程度为准。着色深度：浅棕色者为1 分、棕色者2 分、深棕色者为3 分、不着色为0 分；阳性小管百分比：整块切片中阳性小管占所有小管中的比例< 30 %为1 分、30 %～70 %为2 分、> 70 %为3 分、无细胞着色为0分。最后分值：阳性小管百分比分值乘以着色深度分值。400倍光镜下，每张切片随机选取10个不同的视野。每个视野根据上述评分标准进行评分，一个视野一个评分，10个视野的平均分作为一张切片的平均分。

1.2.4肾脏病理常规检查和肾间质损伤程度评分肾组织用福尔马林固定，石蜡包埋，制成3 μm厚切片，行HE、PASM和MASSON染色。按 以下4 个指标计算肾小管-间质损伤指数：①肾小管变性、坏死；②肾小管萎缩；③间质炎症细胞浸润；④间质纤维化。根据病变的范围及严重程度，按无 、轻度(<2 5% )、中度(25%-5 0 % )、重度(>50% )分别计分为0、1、2、3分。

2结果

2.1不同病理类型肾病综合征患者肾小管megalin表达比较免疫组化结果显示，肾组织megalin表达主要分布于近端肾小管上皮细胞的刷状边缘，见图1。经免疫组化半定量分析，结果显示：MCD组肾小管上皮细胞megalin表 差异；而MN组、FSGS组肾小管megalin表达均比对照组显著降低，也显著低于MCD组(P<0.05,P<0.01)；而FSGS组megalin表达较MN组降低(P<0.05)，见表1和图1。

表1　不同病理类型肾综患者肾小管megalin的表达

vs contril，*P<0.05，**P<0.01；vs MCD group，#P<0.05，##P<0.01；vsMNgroup，&P<0.05。

图1　　不同病理类型肾综患者肾小管megalin的

2.2肾病综合征患者肾小管megalin表达水平与临床指标相关性分析全组肾病综合征患者肾小管megalin的表达水平与尿蛋白定量、血清白蛋白、血肌酐、血尿素氮、胆固醇、甘油三酯、血红蛋白和年龄等临床指标无相关关系；各病理类型亚组肾小管megalin的表达水平也与临床指标无显著相关关系，如表2。

2.3肾病综合征患者肾小管megalin表达水平与肾小管损伤评分的相关性比较全组megalin、MCD亚组megalin、MN亚组megalin表达水平均与肾小管损伤评分存在负相关关系；全组megalin、MCD亚组megalin、MN亚组megalin表达水平均与肾小管萎缩评分存在负相关关系；全组megalin、MCD亚组

表2　肾综患者肾小管Megalin的表达水平与临床指标的相关性分析

megalin表达水平均与间质炎症细胞浸润评分存在负相关关系；全组megalin、MCD亚组megalin、 MN亚组megalin表达水平均与间质纤维化评分存在负相关关系。见表3。

表3　肾小管megalin表达与小管损伤评分相关性

3讨论

在本研究中，我们采用免疫组化方法对不同病理类型肾病综合征患者肾小管megalin的表达情况进行初步探讨。虽然本组三种病理类型肾病综合征患者均表现为大量蛋白尿和严重低蛋白血症，肾功能损害程度也基本相近，但我们的检测结果却发现：与对照组相比，MCD患者肾小管megalin表达无明显变化，而MN患者及FSGS患者肾小管megalin表达量显著降低，以FSGS最为严重，甚至部分FSGS患者肾小管上皮细胞megalin几乎完全丢失。众所周知，这三种病理类型肾病综合征的原发病变在肾小球，而肾小管-间质损伤主要是继发于尿蛋白的毒性，因此，从该结果可以推测：不同病理类型肾病综合征患者尿蛋白对患者肾小管的损伤可能不同。进一步的相关分析发现，肾病综合征患者肾小管megalin表达量与患者尿蛋白排泌量以及其它生化指标却基本无相关关系，而与肾小管损伤总评分以及与肾小管萎缩评分、间质炎症细胞浸润评分和间质纤维化评分呈显著负相关关系，进一步验证上述的推断。事实上，在临床实践中，肾病专科临床工作者常常会发现： FSGS患者肾小管-间质损伤普遍比较突出，而MCD患者肾小管-间质损伤却常常相对较轻，MN患者肾小管-间质损伤相对于FSGS轻而相对于MCD重。我们推测肾病综合征患者肾小管上皮细胞megalin表达下降与肾小管损伤存在内在的联系，值得进一步研究。

为何MN患者和FGSG患者肾小管肾小管megalin表达减少呢？目前尚未明确，但有研究者发现：1型糖尿病肾病患者在出现白蛋白尿的同时，尿中megalin及cubilin排泌量较正常人及未出现蛋白尿的糖尿病患者明显增加[13]，提示megalin 从尿中丢失可能是引起MN和FGSG患者肾小管上皮细胞megalin下降的原因之一，是否同时由于肾小管上皮细胞megalin合成减少，需要进一步研究。紧接的问题：什么机制导致肾小管上皮细胞megalin丢失或者是合成减少呢，目前未见相关文献报道。但我们晚近研究发现：FSGS尿蛋白对肾小管上皮细胞的毒性最强，MN次之，而MCD患者尿蛋白对肾小管上皮细胞的毒性作用却非常微弱[14]，Wen等也有类似报道[15]。因此，我们推测，较为严重肾小球损伤导致肾小管毒性作用较强的尿蛋白成分如转铁蛋白和免疫球蛋白的渗漏导致了肾小管刷状缘损伤而引起megalin从尿中丢失，或者导致肾小管上皮细胞megalin合成减少而导致了肾小管上皮细胞megalin表达减少，究竟由以上哪个因素引起，还是两个因素共同参与，下一步的工作可以通过对不同病理类型肾病综合征患者尿megalin排出量进行检测，可望进一步明确。综上所述，结合我们前期的研究结果[14,16,17]，我们推测不同病理类型肾病综合征患者肾小管上皮细胞megalin表达差异可能由于肾小球损害所漏出的蛋白性质不同而导致对肾小管损伤程度不同所致。

Megalin表达异常可能也是肾病综合征患者蛋白尿形成的重要机制之一。一方面，已有研究发现：在大鼠或狗敲除megalin后，蛋白尿排泌量明显增加[11,18,19]；另一方面，有学者在早期I型糖尿病肾病大鼠模型中发现肾小管上皮细胞megalin表达减低的同时伴有上皮细胞内吞蛋白减少[20]，提示疾病本身或继发因素引起的肾小管上皮细胞功能改变可能通过影响megalin功能而参与蛋白尿的发生。

综上所述，本研究提示，FSGS等病理类型肾病综合征患者由于渗漏进入肾小管的尿蛋白毒性较强，导致肾小管损伤，从而导致肾小管上皮细胞megalin表达减少，而肾小管上皮细胞megalin表达减少又反过来加剧尿蛋白的重吸收障碍，这又反过来加重患者蛋白尿严重程度，针对megalin展开更加深入研究将可能对进一步明确某些病理类型肾病综合征患者肾小管损伤机制和蛋白尿形成机制具有价值，并可能提为肾病综合征的治疗提供新的靶点。

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摘要：目的检测成人不同病理类型肾病综合征患者肾小管Megalin表达的差异，进一步探讨肾病综合征患者蛋白尿形成和肾小管损伤的发生机制。方法选取我院确诊为原发性肾病综合征患者62例，按照肾脏病理分为微小病变组(MCD)、膜性肾病组(MN)、局灶节段硬化组(FSGS)。收集各病例组临床资料以及血清、尿液等临床指标，包括患者病程、起效时间、ALB、BUN、Scr、CH、TG、HB、24小时尿蛋白定量等；应用免疫组织化学方法检测各病例组肾小管megalm的表达；各病例组行肾脏病理常规染色，并根据肾小管损伤标准进行肾小管-间质损伤程度评分。分析肾小管megalin表达量与临床和病理指标的相关关系。结果MCD组肾小管megalin表达量与对照组比较无统计学差异，而MN组、FSGS组肾小管megalin表达均显著低于MCD组和对照组，以FSGS组降低最为显著。各病理类型亚组肾小管megalin的表达水平与临床指标无显著相关关系。全组肾病综合征、MCD亚组、MN亚组megalin的表达水平均与肾小管损伤评分存在负相关关系。结论某些病理类型肾病综合征患者肾小管megalin表达降低可能与蛋白尿毒性有关，megalin表达的下降反过来可能参与这些患者的尿蛋白形成。

关键词：肾病综合征；肾小管；小管损伤；Megalin

Expression of megalin on renal tubule in adult patients with nephrotic syndromeHUANGFUChang-mei1,WANGLi-shu2,LIShang-mei2,etal.(1.FirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China; 2.InstituteofNephrology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

Abstract:ObjectiveExpression of megalin on renal tubule in different pathological types of nephrotic syndrome patients were detected,to explore the possible mechanisms of proteinuria and renal tubule injury.Methods62 primary nephrotic syndrome patients were selected and divided into minimal change disease,membranous nephropathy group and focal segmental sclerosis.Clinical indicators were collected,including duration of patients,onset time,serum albumin,blood urea nitrogen,serum creatinine,cholesterol,triglycerides,hemoglobin,and 24-hour urinary protein.Immunohistochemistry was used to detect the megalin expression on renal tubule of each group.Renal pathology was stained by HE,PASM,and Masson staining,then the renal tubule injury scores were tested according to the the tubular injury standards.ResultsThe results of semi-quantitative analysis showed that the expression of megalin on proximal tubule between the MCD group and control group has no significant difference,the expression of megalin in the MN group and FSGS group was significantly lower than in the MCD group,the expression of megalin in the FSGS group was significantly lower than in the MN group.There were no correlation between megalin expression in proximal tubule and clinical indicators in various pathological subgroups.Negative correlations between megalin expressions and renal tubule injury scores in the whole group,MCD group,MN group were found.ConclusionThe decreasing expressions of megalin on proximal tubule in patients with heavier pathological types of nephrotic syndrome were in relation with the toxicity of urine protein,and this decreasing of megalin expression then contribute to formation of proteinuria.

Key words:Nephrotic syndrome;tubular;tubule injury;Megalin

收稿日期：(2014-06-11)

作者简介：皇甫长梅，女，在读博士研究生，副主任医师；王丽姝，女，在读硕士研究生;刘华锋(1969-)，男，教授，博士生导师，主要从事免疫性肾小球疾病发病机制方面的研究.

文献标识码：A

中图分类号：R392

文章编号：1007-4287(2015)04-0557-05

通讯作者*皇甫长梅、王丽姝共同为第一作者

基金项目：国家自然科学基金(30971370/C140405)