高血压患者体内脯氨酸寡肽酶酶学活性的临床研究

曾　彦，王　东，许晶晶，张宇清

(中国医学科学院·北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院 心内科，北京100037)



高血压患者体内脯氨酸寡肽酶酶学活性的临床研究

曾彦，王东，许晶晶，张宇清*

(中国医学科学院·北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院 心内科，北京100037)

摘要：目的检测高血压患者体内脯氨酸寡肽酶(prolyl oligopeptidase,POP)酶学活性变化并探讨这一变化与各临床指标的相关性。方法选取2012年8月1日至2014年6月1日间就诊于北京阜外心血管病医院的高血压1级患者45例、高血压2级患者26例，高血压3级患者24例及正常血压受试者27例。所有参与者均行体格及超声心动图检查，并抽取静脉血以测定POP酶学活性以及相关生化指标。采用Pearson线性相关分析确定参数之间的变化及关系。结果与对照组相比，高血压患者POP酶学活性减低(1级高血压1.40±0.56 U、2级高血压1.13±0.60 U、3级高血压1.10±0.58 U，对比对照组1.82±0.47 U，均P<0.01)，与高血压1级患者相比，高血压2级和3级患者血浆中POP酶学活性减低(P<0.05)。Pearson线性相关分析提示POP酶学活性与收缩压、舒张压、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、左心室心肌质量指数相关(均P<0.05)。结论POP酶学活性随着高血压程度的加重而减低。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0739)

肾素血管紧张素系统在高血压的发生发展中发挥着重要作用。脯氨酸寡肽酶(prolyl oligopeptidase,POP)作为一种能水解血管紧张素(angiotensin,Ang)Ⅰ、Ⅱ的肽酶，可以将Ang I，Ang Ⅱ分子水解，生成Ang(1-7)[1]。Ang(1-7)是近年来发现的血管紧张素家族成员之一，具有扩张动脉血管、降低血压、抗血管平滑肌细胞增殖等作用[2]。因此，POP活性的改变，可能会导致Ang(1-7)的生成减少，AngⅠ和AngⅡ蓄积增多，进而导致高血压的发生发展。研究发现POP能降解多种神经肽、激素、细胞因子，如血管紧张素、P物质、促甲状腺激素释放激素、促性腺激素释放激素等，提示其在血压的调节以及精神障碍中起重要作用，而POP在脑中的浓度最高，引起了用其抑制剂治疗认知和精神障碍的研究热潮[3]。但国内外关于POP对高血压发生发展的直接作用及其机制的相关报道较少，在高血压患者中是否存在POP活性的改变值得研究和探讨。本文通过检测不同程度高血压患者体内POP血清学活性，并与正常血压人群进行比较，观察其酶学活性的变化，探讨这一变化与各临床指标的相关性，为进一步的基础医学研究提供临床依据。

1资料与方法

1.1研究对象选取2012年8月1日至2014年6月1日间就诊于北京阜外心血管病医院的高血压病患者(高血压组)和健康查体者(对照组)。高血压组患者入选标准：①新发现高血压且未曾服用任何抗高血压药物患者；②均符合《中国高血压防治指南2010》(指南)[4]关于原发性高血压的诊断标准；③男女不限，年龄35-70岁。高血压患者排除标准：①不符合入选标准者；②合并有严重肝肾功能不全、恶性肿瘤等疾病者；③合并有器质性心脏病者；④合并有血糖不可控制的糖尿病者。高血压组所有入选对象按照血压的级别分为三个亚组：1级高血压组 [收缩压140-159 mm Hg和(或)舒张压90-99 mm Hg]，2级高血压组[收缩压160-179 mm Hg和(或)舒张压100-109 mm Hg]和3级高血压组[收缩压≥180 mm Hg和(或)舒张压≥110 mm Hg]。

对照组入选标准：健康体检人员，年龄35-70岁，均无高血压病史和家族史，血压均处于正常高值范围内(收缩压<140 mm Hg，舒张压<90 mm Hg)，实验室检查、心电图和超声心动图检查均正常。对照组最终入选27例研究对象，男性15例，女性12例，平均(50.1±7.5)岁。

1.2　方法

对所有参与者进行体格检查，测量身高、体重，并按照指南推荐的标准测量方法测量收缩压和舒张压。所有参与者均经隔夜禁食8-12 h，次日清晨抽取空腹肘静脉自凝血7 ml，分装两个试管，其中4 ml送本院检验科测定空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)等指标，3 ml待其凝血后离心分离血清，于-80℃冰箱保存，用于测定POP活性。

采用GE vivid 7 彩色多普勒超声诊断仪，探头频率为1-3 MHz。受检者取左侧卧位，平静呼吸，同步连接Ⅱ导联心电图。应用经胸M 型超声、二维超声测量左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVED)、左心室室间隔(interventricular septal thickness,IVST)及后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)；据Devereux校正公式[5]计算左心室质量指数(left ventricular mass index,LVMI)；以M型超声测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)；应用脉冲多普勒测量二尖瓣血流频谱左室舒张早期(E)与舒张晚期的峰值流速(A)及比值(E/A)。

左心室质量(left ventricular mass，LVM，g)：LVM=O.8×{1.04×[(LVED+IVST+LVPWT)3-LVED3]}+0.6；

LVMI(g/m2)=LVM/体表面积，体表面积=0.0061×身高+0.0128×体重-0.1529)

采用荧光分析方法测定POP活性[6]，试剂盒由瑞士Bachem公司提供。每个反应体系包含10 μL血浆及90 μL缓冲液(50 mM Hepes，pH 7.5，250 mM NaCl；1 mM EDTA；1 mM DDT；150 μM Z-glycyl-prolyl-4-methylcoumarinyl-7-amide)，37°C孵育1 h。在340 nm紫外线激发下测定其荧光强度，来反应POP的酶学活性。

1.3　统计学分析

2结果

2.1　一般资料

三组间年龄和性别差异无统计学意义。与对照组相比，高血压患者收缩压、舒张压、甘油三酯、总胆固醇、LDL-C升高，HDL-C减低，体重指数及空腹血糖差异无统计学意义，见表1。与对照组相比，高血压患者POP酶学活性较低(P<0.01)，且与高血压1级患者相比，高血压2级和3级患者其血浆中POP酶学活性较低(P<0.05)，高血压3级组的POP酶学活性虽较2级组低，但组间比较无明显统计学差异(P>0.05)，见表1。

±s)

注：POP：脯氨酸寡肽酶；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇。与对照组相比，aP<0.01，cP<0.05；与1级高血压组比较，bP<0.05。

2.2　各组超声指标

对照组和高血压患者IVST、LVPWT、LVMI、二尖瓣口舒张晚期A峰值及E/A差异均有统计学意义(P<0.01)；LVED及LVEF差异无统计学意义(P>0.05)。与1级高血压组相比，2级和3级高血压组IVST、LVPWT和LVMI增大，E/A减小，且有显著性统计学差异(组间比较，均P<0.05)。高血压3级组比2级组的IVST、LVPWT和LVMI增大，E/A减小，但组间比较无统计差异(组间比较，均P>0.05)，见表2。

±s)

注：IVST：左心室舒张末期室间隔厚度；LVPWT：左心室舒张末期左室后壁厚度；LVED：左心室舒张末期内径；LVMI：左心室质量指数；LVEF：左心室射血分数；E：二尖瓣口舒张早期血流峰值速度；A：二尖瓣口舒张晚期血流峰值速度；E/A：E峰与A峰比值。与对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与1级高血压组比较，cP<0.05，dP<0.01。

2.3　Pearson线性相关分析

Pearson线性相关分析提示POP酶学活性与收缩压、舒张压、甘油三酯、HDL-C、LVMI相关(P<0.05)，见表3。偏相关分析显示，依次控制其他临床指标，如年龄、体重指数、空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、LDL-C、HDL-C以及LVMI之后，POP酶仍与收缩压和舒张压相关(分别r=-0.238和-0.215，均P<0.05)。

表3　 POP酶学活性与临床指标的Pearson相关性分析(n=122)

注：POP：脯氨酸寡肽酶；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LVMI：左心室质量指数。

3讨论

本研究通过比较正常血压人群和新发高血压患者血中POP酶学活性，证实高血压患者中，POP酶学活性随着高血压程度的加重而水平较低。线性分析显示，控制其他临床指标之后，POP酶仍与收缩压、舒张压相关。这些证据提示POP酶学活性的减低在高血压发生发展中可能有重要作用。

肾素血管紧张素系统的过度激活是高血压发生发展的一个重要机制，而POP可将Ang Ⅰ、Ang Ⅱ分子水解，生成Ang(1-7)[1,7]。POP酶是一种广泛分布于组织中的丝氨酸内肽酶[8]，因不能降解大分子蛋白质被命名为脯氨酰寡肽酶。已知POP酶在肾皮质中特别丰富，但其最初发现于人类子宫，它有降解催产素的作用，该酶对AngⅠ、AngⅡ、缓激肽和加压素等多肽有活性作用。另有研究显示，在中枢神经系统中POP有影响学习和记忆的功能，这些发现也推动了几种高亲和力特异性抑制剂的研发[9]，例如，S-1709在大鼠体内(POP的一种高度特异的抑制剂)对POP的 Ki为1.3 nM，且对其他肽酶无抑制作用，包括氨肽酶M，二肽基肽Ⅳ，脑啡肽酶，内肽酶3.4.24.15和3.4.24.16，钙蛋白酶和血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)。已有学者推测POP可能有调节血压的作用[10]。有人曾建立了POP基因敲除小鼠模型，但并未报道这些小鼠的血压值[11]。

另外，POP的催化产物Ang(1-7)是新近发现的Ang家族新成员，研究显示，通过一氧化氮、前列腺素的介导，非降压剂量的Ang(1-7)即可扩大缓激肽的扩血管效应[12]；Ang(1-7)可通过局部缓激肽的作用并依赖一氧化氮的机制实现中枢降压作用[13]；Ang(1-7)还可以减少Ang Ⅱ引起的血管平滑肌细胞内钙离子浓度的升高，并抑制血管平滑肌细胞增殖，进而影响血管和心脏的功能[14]。因此，Ang(1-7)具有扩张动脉血管、降低血压、抗血管平滑肌细胞增殖等特点。POP作为生成Ang(1-7)的主要肽酶，其活性的高低直接影响到Ang(1-7)上述功能的发挥。因此，本团队推测，体内POP酶学活性的减低可能会导致Ang(1-7)生成的不足，进而影响其功能的发挥，导致高血压的发生和发展，而本研究中还发现血压与POP酶活性呈负相关，更加证实了POP与高血压发展之间的关系。

对于高血压患者中为何存在POP酶学活性的偏低，尚未有明确的机制进行解释。 Cumming等[15]发现，氧化应激状态可以使POP分子内部形成二硫键,这使POP分子内的β螺旋片层区域的片层之间，及β螺旋片层区域和β水解酶区域之间不能协调地相对运动，导致POP的催化活性位点无法暴露给底物，丧失水解底物的能力，继而表现为与这些底物有关的病理生理状态改变，如血压和心脏舒张功能的改变。本团队认为，可能是由于高血压患者体内存在炎症及氧化应激等病理生理过程，POP分子在氧化应激条件下，内部二硫键形成，酶学活性降低。

最近的一项研究中，分别给野生型、C-KO(携带点突变的基因工程小鼠，其ACE的C-末端催化结构域可被特异性灭活)和N-KO(携带点突变的基因工程小鼠，其ACE的N-末端催化结构域可被特异性灭活)三组小鼠连续输注AngⅡ两周，显示在第14天，C-KO组与野生组间的血压值无显著差异，而N-KO组的血压则明显高于其余两组；随后的研究中，用POP抑制剂(S-17092)对N-KO和野生型小鼠均进行预处理后，再予等剂量的AngⅡ，发现经S-17092预处理的N-KO小鼠的血压值与野生组持平，低于未经S-17092预处理的N-KO小鼠组；该研究还发现尽管N-KO组的血清AcSDKP(AcSDKP是一种小分子肽，由POP酶水解产生，该过程可以被S-17092抑制)水平明显升高，但它并不是引起N-KO小鼠血压升高的原因[16]。上述结果说明，在控制血压过程中，POP酶和ACE的作用间可能存在一个重要平衡，但POP抑制剂的具体降压作用机制并不清楚，认为可能有其它POP产物也与ACE的N-末端相互作用。虽然该试验结果与本研究结果相互矛盾，实质上均说明POP有影响血压的作用，但是由于其作用过程复杂，可能涉及到多路径、需多种因子的参与，其中任一环节发生改变都将不同程度地影响血压，故其结果究竟是升压作用还是降压作用，还需根据具体的路径加以分析。另有两项关于脯氨酰羧基肽酶(prolylcarboxypeptidase，PRCP)的研究。PRCP又称血管肽酶C，其作用机制是通过代谢AngⅡ、AngⅢ分别生成Ang1-7 和Ang2-7[17]，具有与POP类似的作用过程。研究发现，氯沙坦能有效降低大鼠血压和逆转肠系膜动脉肥厚，其作用机制可能与PRCP的表达上调有关[18]。在氯沙坦对两肾一夹高血压大鼠的研究中发现，氯沙坦能显著升高非手术侧肾脏组织中PRCP、血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶的蛋白表达，降低TGF-β1蛋白的表达，认为这一作用可能与其增强大鼠体内PRCP-血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶调节轴功能、降低TGF-β1蛋白的表达有关[19]。综合以上研究结果，目前，POP调控血压的具体路径尚不明确，需进一步的基础和临床试验加以论证。

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关键词：高血压；脯氨酸寡肽酶；血管紧张素；超声心动图

Evaluation of prolyl oligopeptidase enzymatic activity in hypertensive patientsZENGYan,WANGDong,XUJing-jing,etal.(CardiologyDepartment，FuwaiHospital，NationalCenterforCardiovascularDiseases，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100037，China)

Abstract:ObjectiveTo determine the enzymatic activity of prolyl oligopeptidase (POP) in hypertensive patients and explore the relations between the changes of POP enzymatic activity and clinical features.MethodsForty-five patients with grade 1 hypertension,26 patients with grade 2 hypertension，24 patients with grade 3 hypertension and 27 normotensives were included in the present study,who were selected from Fuwai Hospital from 1st August,2012 to 1st June,2014.All the participants underwent physical and echocardiographic examinations.Meanwhile,fasting blood was collected to determine the POP enzymatic activity and routine biochemical indicators.ResultsCompared with the controls,POP enzymatic activities were significantly reduced in hypertensive patients (grade 1 hypertention 1.40±0.56 U，grade 2 hypertention 1.13±0.60 U，grade 3 hypertention 1.10±0.58 U vs the controls 1.82±0.47 U，allP<0.01),and this reduction was more evident in patients with grade 2 or 3 hypertention as compared to ones with grade 1 hypertention(P<0.05).Pearson correlation analysis showed that POP enzymatic activity was significantly associated with systolic blood pressure,diastolic blood pressure,triglyceride,high density lipoproteins and left ventricular mass index(P<0.05).ConclusionPOP enzymatic activity was reduced with the increasing blood pressure.

Key words:Hypertension;Prolyl oligopeptidase;Angiotensin;Echocardiography

(收稿日期：2014-10-05)

文献标识码：A

中图分类号：R544.1

文章编号：1007-4287(2015)05-0739-05

*通讯作者