适配子在肿瘤研究中的应用进展＊

甘晓云，伍锡栋，刘 涛综述，张五萍△审校

（1.江西省人民医院药剂科，南昌330006；2.江西省药物研究所药理室，南昌330006）

在20世纪90年代初，美国的Tuerk等［1－2］在实验室中发明了一种叫做指数富集配基的系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术，由此技术筛选出来的寡核苷酸命名为适配子（aptamers）。适配子可以和抗体媲美，甚至优于抗体。具有以下特点［3］：（1）可以保持蛋白的天然结构属性，性能稳定，可以常温运输、长期保存；（2）筛选适配子过程简单，周期短（一般2个月左右）；（3）相对分子质量比抗体分子小，具有快速的血浆清除率、高组织穿透力、免疫原性低、变性可逆（数分钟内可以再生，因此可以反复使用）；（4）可在适配子中插入基因组或化学合成修饰（镜像异构适配子、糖基化、连接在大分子载体等方法）实现多层面调控，可直接用于生物检测、诊断及肿瘤靶向治疗。现结合肿瘤方面阐述细胞SELEX（Cell-SELEX）及其适配子在肿瘤研究中的应用及意义。

1 采用Cell-SELEX技术筛选适配子

Cell-SELEX技术是将整个细胞作为靶标筛选出特异性结合的寡核苷酸适配子的方法，该技术可以不需要了解靶细胞的分子组成、蛋白结构及其他差异性信息，其核心技术是利用任意2种完整的活细胞膜表面分子水平之间的差异来筛选能特异性识别靶细胞的适配子，以准确地区分正常细胞和靶细胞。具体方法：将体外用组合化学的方法合成随机寡核苷酸序列DNA／RNA作为筛选的原库，与靶细胞（一般选择过表达细胞）孵育以筛掉不与靶细胞结合的序列，再与同源细胞系为对照细胞（一般选择低表达／不表达细胞）孵育以筛掉与靶细胞和对照细胞都结合的序列，得到的特异性序列经过体外PCR／RT-PCR扩增技术，得到的双链PCR样品，经过8%尿素胶／链霉亲和素磁珠分离等方法得到单链DNA／RNA用于下一轮筛选的次文库。经过多轮筛选（一般5～20轮），最终获得的单链DNA／RNA进行克隆测序，分析序列同源性得到与靶细胞高亲和力、特异性强结合的适配子。

2 在标志物发现上的应用

2.1 在肿瘤标志物上的应用 由于在癌变的过程中，相关的基因表达异常导致了癌细胞各种表面分子尤其是蛋白水平的改变。陈文学等［4］应用荧光标记适配子，与流式细胞技术结合，对正常鼻咽癌上皮细胞株与鼻咽癌细胞株进行Cell-SELEX消减筛选出特异性适配子。目前，应用Cell-SELEX技术筛选得到了针对肿瘤相关蛋白血小板衍生生长因子（plateletderived growth factors，PDGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、HER3、NF-κB、Tenascin-C、Nucleolin以及甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）［5］、黏蛋白1（mucin1，MUC1）等核酸适配子已广泛应用于肿瘤的诊断和靶向治疗研究［6］。

2.2 在病毒、细菌标志物上的应用［7］近年来，在人类免疫缺陷病毒（HIV）gag相关蛋白、大肠杆菌以及抗菌药物（四环素、新霉素和青霉素类抗菌药物等）等方面多有报道。Handy等［8］用毒素－蛋白联合物的方法筛选出首个海洋毒素STX的适配体，并且能运用到食源性毒素检测中。适配子与靶分子结合能力强，解离度常数（kd）常在pmol／L～nmol／L之间。Hamula等［9］运用改良Cell-SELEX筛选出嗜酸乳酸菌的完整活细胞的适配体，其平均解离系数为 （13±3）nmol／L，并得到hemag1P特异性和亲和力最高。Khati等针对变异株病毒gp120部分保守区域（结合细胞因子）筛选得到2′F-RNA适配子不但能高亲和力结合gp120，而且将抑制HIV-1感染人外周血单核细胞（PBMCs）的活性提高了1 000倍。Wang等［10］筛选出朊病毒蛋白的适配子，可以特异识别不同构象的朊蛋白，避免了抗体的局限性，因而有可能用于疯牛病等疾病的诊断。

3 在肿瘤诊断中的应用

3.1 适配子与生物工具结合性诊断应用 目前，Cell-SELEX筛选得到的适配子应用在诊断上主要有流式细胞分析法、生物／压电生物传感器、生物质谱、表面增强拉曼散射等。核酸适配子具有优越于抗体独特的性质，结合现代细胞遗传学以及分子生物学的MICM等技术，使得诊断手段由细胞水平上升到亚细胞水平及分子水平。诸如生物传感器技术的发展，核酸适配子－生物芯片复合物等在临床诊断上的应用，与Cell-SELEX技术在临床诊断上取得了较好效果，如刘星等［11］用生物传感器-SELEX技术对弓形虫（TOX）等进行了多通道间检测，检测系统稳定性良好，线性检测范围理想。有报道核酸适配子也可以制成生物芯片，用于体内分子成像研究，能特异性地同时定量检出3种混于血清和细胞提取物中肿瘤相关蛋白（次黄嘌呤单磷酸脱氢酶Ⅱ、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子）。

3.2 适配子作为探针性诊断应用 基于适配子的特异性识别功能，可以设计出很多应用在临床上检测诊断的新方法，如以荧光染料［12］、纳米粒子及电化学活性探针等多种探针性应用形式增加检测灵敏度。Shi等［13］利用TD05与荧光染料Cy5组成Cy5-TD05探针成功用于B细胞性淋巴瘤移植小鼠的体内分子成像，可以更准确地靶向诊断肿瘤；Gao等［14］合成的适配子GMT8-纳米粒子能有效定位于恶性胶质瘤移植小鼠的肿瘤位点；Chen等［15］用连有抗肝癌细胞核酸适配体的荧光共振能量转移（FRET）纳米粒实现了对不同肿瘤细胞的检测；Avci-Adali等［16］设计了一个可激活的核酸适配体荧光探针用于体内肿瘤成像，这种探针只有在与细胞膜表面蛋白结合后，才会引起探针上的荧光分子激发，从而用于肿瘤早期组织的检测诊断。诸多适配子的探针性检测方法不仅灵敏度高，而且特异性强，对肿瘤发生的早期诊断和防治具有积极的意义。

4 在肿瘤治疗中的应用

近来研究发现，第1个通过美国食品药品管理局（FDA）批准的适配子药物 Macugen［17］对糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病视网膜病和视网膜静脉狭窄也有一定的治疗效果［18］。目前，针对核仁蛋白的AS1411适配子已经进入临床试验。靶向药物可以提高肿瘤的治疗效率，降低药物治疗产生的毒副作用，适配子与细胞的结合具有很好的靶向性，常与现代生物技术结合应用于肿瘤靶向治疗中，本身作为靶向材料／运输工具与化疗药物耦联形成轭合物，以及应用于纳米脂质体、小分子干扰RNA等技术。

适配子具有相对安全、血浆清除率快、组织穿透力强、价格适中等优点。Meng等［19］将适配子TLS11a-GC与多柔比星组成TLS11a-GC-Dox轭合物能特异性结合肝癌细胞LH86并抑制肝癌细胞增长；Gao等［14］借助纳米分子生物化学技术，合成适配子GMT8-多西紫杉醇－纳米粒子靶向药物提呈系统以诱导恶性胶质瘤细胞凋亡和抑制肿瘤生长；Rao等［20］通过脂质体法将抗HPV16-E6核酶、空载体质粒分别导入宫颈癌CaSki细胞，对照发现转染核酶的CaSki细胞E6基因的表达明显减少，对化疗药物顺铂敏感性增加了2 128倍，细胞凋亡率明显增加；Zhang等［21］以乳腺癌细胞 MCF-10ATI为靶细胞筛选出的适配子KMF2-1a能特异运送大分子链霉亲和素进入靶细胞，若将KMF2-1a结合其他介质如化疗药物用于乳腺癌诊治或许能产生靶向治疗的作用；Kurosaki等［22］研发出一种由质粒DNA、聚乙烯亚胺和MUCI组成的肿瘤靶向基因输送系统，显著抑制表达MUCI人类肺癌细胞株A549细胞的生长。

5 适配子的应用前景

目前，适配子实际应用仍受诸多限制，在人体内使用的安全性以及稳定性等评价尚需做很多工作。近20年来，Cell-SELEX技术在不断地革新，尤其是新型的分子生物技术以及材料等高科技技术的不断发展，如流式细胞分析技术、原子力显微镜技术、小分子RNA干扰技术以及生物芯片、纳米技术等前沿技术的发展，适配子筛选技术将能很好地促进肿瘤标志物的发现、早期诊断以及靶向治疗。Cell-SELEX筛选技术与分子生物学技术组合的新技术也在不断出现，诸如与光学适体传感器的结合、生物共振、免疫组织化学荧光等多重组合。相信随着针对适配子在肿瘤研究的不断深入，越来越多针对肿瘤、病毒以及细菌等靶分子筛选的适配子将被更多地应用于临床，对肿瘤的临床诊断治疗及药物的研究开发都将带来更广阔的前景。

［1］ Tuerk C，Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase［J］.Science，1990，249（4968）：505-510.

［2］ Ellington AD，Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands［J］.Nature，1990，346（6287）：818-822.

［3］ Sefah K，Shangguan D，Xiong X，et al.Development of DNA aptamers using Cell-SELEX［J］.Nat Protoc，2010，5（6）：1169-1185.

［4］ 陈文学，张焜和，邹学森，等.SELEX法筛选鼻咽癌核酸适配子的研究［J］.山东医药，2012，52（23）：31-33.

［5］ Lee YJ，Lee SW.Regression of hepatocarcinoma cells using RNA aptamer specific to alpha-fetoprotein［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，417（1）：521-527.

［6］Syed MA，Pervaiz S.Advances in aptamers［J］.Oligonucleotides，2010，20（5）：215-224.

［7］ Ni X，Castanares M，Mukherjee A，et al.Nucleic acid aptamers：clinical applications and promising new horizons［J］.Curr Med Chem，2011，18（27）：4206-4214.

［8］ Handy SM，Yakes BJ，DeGrasse JA，et al.First report of the use of a saxitoxin-protein conjugate to develop a DNA aptamer to a small molecule toxin［J］.J Int Soc Toxinol，2013，61：30-37.

［9］ Hamula CL，Zhang H，Guan LL，et al.Selection of aptamers against live bacterial cells［J］.Anal Chem，2008，80（20）：7812-7819.

［10］Wang P，Hatcher KL，Bartz JC，et al.Selection and characterization of DNA aptamers against PrP（Sc）［J］.Exp Biol Med（Maywood），2011，236（4）：466-476.

［11］刘星，秦莲花，罗阳，等.快速检测TOX、CM VIgG抗体的适配子型SPR传感器微阵列的初步构建［J］.第三军医大学学报，2012，34（8）：765-767.

［12］王丽，张存政，刘媛，等.基于分子信标的有机磷农药适配体活性位点分析及改造［J］.分析化学，2012，40（6）：940-944.

［13］Shi H，Tang ZW，Kim YM，et al.In vivo fluorescence imaging of tumors using molecular aptamers generated by cell-SELEX［J］.Chemistry-An Asian J，2010，5（10）：2209-2213.

［14］Gao H，Qian J，Yang Z，et al.Whole-cell SELEX aptamerfunctionalised poly（ethyleneglycol）-poly（ε-caprolactone）nanoparticles for enhanced targeted glioblastoma therapy［J］.Biomaterials，2012，33（26）：6264-6272.

［15］Chen X，Estévez MC，Zhu Z，et al.Using aptamer-conjugated fluorescence resonance energy transfer nanoparticlesfor multiplexed cancer cell monitoring［J］.Anal Chem，2009，81（16）：7009-7014.

［16］Avci-Adali M，Paul A，Wilhelm N，et al.Upgrading SELEX technology by using lambda exonuclease digestion for single-stranded DNA generation［J］.Molecules，2009，15（1）：1-11.

［17］Ng EW，Shima DT，Calias P，et al.Pegaptanib，a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5（2）：123-132.

［18］Zechmeister-Koss I，Huic M.Vascular endothelial growth factor inhibitors（anti-VEGF）in the management of diabetic macular oedema：a systematic review［J］.Br J Ophthalmol，2012，96（2）：167-178.

［19］Meng L，Yang L，Zhao XX，et al.Targeted delivery of chemotherapy agents using a liver cancer-specific aptamer［J］.PLoS One，2012，7（4）：e33434.

［20］Rao ZG，Gao JF，Zhang BC，et al.Cisplatin sensitivity and mechanisms of anti-HPV16E6-ribozyme on cervical carci-noma CaSKi cell line［J］.Chinese-German J Clin Oncol，2012，11（4）：237-242.

［21］Zhang K，Sefah K，Tang L，et al.A novel aptamer developed for breast cancer cell internalization［J］.Chem Med Chem，2012，7（1）：79-84.

［22］Kurosaki T，Higuchi N，Kawakami S，et al.Self-assemble gene delivery system for molecular targeting using nucleic acid aptamer［J］.Gene，2012，491（2）：205-209.