α-enolase蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义

朱礼昆，杨蔚琪，杨 云

（昆明医科大学第二附属医院 整形外科，云南 昆明 650032）

α-enolase（ENO1） 是烯醇化酶家族中3种同功酶之一，是一种多功能的蛋白，作为糖酵解过程中的关键酶，α-enolase广泛分布在原核和真核细胞的细胞质中，其基因表达随细胞病理生理、代谢、发育状况的不同而改变[1]。Jiang等[2]通过构建结肠癌相关生物学网络研究发现：α-enolase与细胞增殖、细胞凋亡、细胞分裂、细胞迁移、蛋白质水解等生物学过程相关联，并且是结肠癌相关生物学网络的中心基因之一，这提示α-enolase可能在肿瘤发生发展过程中发挥着重要的作用。口腔鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，其发病率位于口腔颌面部肿瘤的首位，并且近年来仍有上升趋势。本研究通过测定α-enolase在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，探讨其与口腔鳞癌发生发展的关系，这对揭示口腔鳞状细胞癌发生、发展的精确分子机制，设计合理的治疗药物及判断预后，进一步提高我国口腔鳞状细胞癌的治疗水平具有重要意义。

材料和方法

一、一般资料 收集2010年1月-2012年10月昆明医科大学第二附属医院整形外科术前未经任何治疗的口腔鳞状细胞癌蜡块40例，其中男性24例，女性16例，平均年龄58.5岁，淋巴结转移者12例，根据肿瘤分化程度分为低分化、中分化和高分化鳞癌，根据国际抗癌联盟（UICC） 2002年口腔癌分期标准，包括I+II期25例，III+IV期15例。对照组10例，均为正常口腔黏膜组织。

二、主要实剂及仪器 ELISA试剂盒：北京鑫方程生物技术有限公司，产品编号FU-E10980。PCR仪：ABI仪器型号9700。基因组提取试剂盒：庄盟生物，产品编号ZP311 2X。SYBR MIX：庄盟生物，产品编号ZF101。

三、方法 1．ELISA定量测定α-enolase浓度：操作步骤参照文献[3]。

2．利用real-time PCR测定α-enolase mRNA表达：用TRIzol法抽提总mRNA，测定其浓度和纯度，用RT-PCR逆转录试剂盒逆转录为cDNA后进行PCR扩增。α-enolase上游引物：5'-ATTGAGCTAGATGGGACCGAGAAT-3'，下游引物：5'-CACTGGGAGTATGAGGTCAGGGTT-3'，PCR产 物159bp；β-actin上游引物：5'-TCATGAAGTGTGACGTGGACA-3'，下 游 引 物： 5'-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3'，PCR 产 物158bp。PCR条 件：95℃预变性2min，95℃变性2s，59℃退火延伸30s，50个循环；72℃终延伸12s。

结 果

一、口腔鳞状细胞癌中α-enolase蛋白的表达由附图可见，口腔鳞状细胞癌组织中α-enolase蛋白表达明显高于正常粘膜组织（P＜0.05）；由表1可见：α-enolase蛋白在低、中、高分化口腔鳞状细胞癌组织中表达均有差异（P＜0.05），差异具有统计学意义，高分化鳞癌的α-enolase浓度＞中分化鳞癌＞低分化鳞癌；有淋巴结转移、TNM分期为III+IV期者α-enolase的表达分别明显高于无淋巴结转移、TNM分期为I+II期者（P＜0.05）。

二、口腔鳞状细胞癌中α-enolase蛋白表达与临床病理参数间的关系 由表2可见，α-enolase在口腔鳞状细胞癌中的表达与淋巴结转移、TNM分期、肿瘤分化程度密切相关（P＜0.05），而与患者的年龄、性别无关（P＞0.05）。

附图 口腔鳞状细胞癌、正常粘膜组织中α-enolase蛋白结果比较

表1 口腔鳞状细胞癌α-enolase浓度（±s,ng/ml）

表1 口腔鳞状细胞癌α-enolase浓度（±s,ng/ml）

注：低分化鳞癌与中分化鳞癌比较▲P＜0.05；中分化鳞癌与高分化鳞癌比较△P＜0.05；低分化鳞癌与高分化鳞癌比较◇P＜0.05；淋巴结转移与无淋巴结转移比较●P＜0.05；III+IV期患者与I+II期比较☆P＜0.05。

组分 n淋巴结转移 12无转移 28 α-enolase浓度960.6±15.40 857.86±30.45●P 0.036低分化 16 839.28±17.49 0.029中分化 12 906.00±11.92▲ 0.032高分化 12 987.06±16.79△◇ 0.048 III+IV期 15 998.86±30.45☆ 0.021 I+II期 25 852.87±14.24

表2 口腔鳞状细胞癌中α-enolase蛋白表达与临床病理参数间的关系

讨 论

烯醇化酶（enloase，ENO） 是糖酵解途径中催化2-磷酸甘油酸转变为磷酸醇式丙酮酸的酶，烯醇化酶家族包括α-enolase（ENO1）、β-enolase和γ-enolase。α-enolase作为一种糖酵解酶，广泛分布在原核和真核细胞的细胞质中，是一个高度保守的胞浆酶类，由两个含有433个氨基酸，分子量约47kDa的亚单位反向平行结合构成的二聚体，在细胞质中起催化作用，形成磷酸烯醇式丙酮酸[4]。在临床上，γ-enolase已作为一种常用于指导小细胞肺癌患者的疗效监测、复发预测和预后评估的血清肿瘤标志物。

以往认为糖酵解代谢酶的生物学活性只是催化能量代谢，然而Kim等[5]研究发现糖酵解酶都是具有多功能的蛋白，其所涉及的其他生物学功能与肿瘤的发生发展过程密切相关；最近研究发现，烯醇化酶是一种多功能蛋白，其多样性主要体现在细胞定位和功能上[6]。位于细胞膜的α-enolase能促进肿瘤细胞侵袭和转移，α-enolase蛋白的C端具有一个跨膜结构域（包含16个氨基酸），以此锚定于细胞膜[7]。Jiang及同事[2]通过构建结肠癌相关生物学网络研究发现：α-enolase与细胞增殖、细胞凋亡、细胞分裂、细胞迁移、蛋白质水解等生物学过程相关联，并且是结肠癌相关生物学网络的中心基因之一，这提示α-enolase可能在肿瘤发生发展过程中发挥着重要的作用。

在临床上，γ-enolase已作为一种用于指导小细胞肺癌患者的疗效监测、复发预测和预后评估的血清肿瘤标志物。鉴于α-enolase与γ-enolase是同一家族，近年来越来越多的研究者开始关注α-enolase作为肿瘤标志物的潜能。目前在肿瘤组织中α-enolase的表达水平及其与患者临床相关性尚无明确定论，有研究发现，在转移性肺癌的肺泡Ⅱ型肺泡、小细胞肺癌、头颈癌患者肿瘤组织中，α-enolase表达水平是上调[8-10]。2003年Chang及其同事研究发现，在非小细胞肺癌患者肿瘤组织中，α-enolase表达水平显著下调，α-enolase表达水平与肺癌患者预后相关，其表达量越低，患者预后越差[11]，这提示α-enolase可能抑制肿瘤发生发展过程。然而更多研究表明，α-enolase与肿瘤发生发展存在正相关。α-enolase作为肺癌相关抗原，在非小细胞肺癌患者肿瘤组织和胸腔积液中的肿瘤细胞中高表达，其表达量越高，患者预后越差[12]；头颈癌患者肿瘤组织中α-enolase显著高于正常对照组，其表达量越高，患者预后越差[13]；乳腺癌患者肿瘤组织中α-enolase的mRNA水平显著高于配对正常组织，并且这种改变在雌激素受体阳性（ER+） 的乳腺癌亚型中尤明显，α-enolase表达水平越高，患者预后越差[14]。

口腔鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，其发病率位于口腔颌面部肿瘤的首位，并且近年来仍有上升趋势。本研究通过ELISA法测定α-enolase在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，结果发现：口腔鳞状细胞癌组织中α-enolase蛋白表达明显高于正常粘膜组织，α-enolase的高表达量与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关，随着淋巴结转移及肿瘤分化程度、TNM分期的增加，α-enolase的表达会增加，提示在口腔鳞状细胞癌组织中α-enolase蛋白表达上调，α-enolase可能在口腔鳞状细胞癌中的发生、发展起着重要作用，这与在其他肿瘤中的研究结论基本相-致[8-10]，但这些研究多以肿瘤组织与癌旁组织为标本，多应用免疫组化方法进行研究的，而我们的实验是以肿瘤组织与正常人黏膜组织为标本，应用ELISA方法进行研究。总之，本研究虽然通过测定α-enolase在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，探讨其与口腔鳞癌发生发展的关系，发现α-enolase在口腔鳞状细胞癌的发展过种中起着重要作用，但只是停留在分子表浅层面，对临床诊断和治疗能提供些参考和建议，究其根源需要在基因水平上明确α-enolase在肺腺癌组织中的表达情况，进一步明确α-enolase在口腔鳞状细胞癌中所占居的重要地位，进而尽早明确是否可以应用于临床诊断和治疗。

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