DNA错配修复基因与大肠癌相关性的研究进展

钟子劭　王　静

DNA错配修复基因与大肠癌相关性的研究进展

钟子劭王静

【提要】DNA错配修复是机体内DNA修复机制的一种重要形式，在防止基因突变和维持基因组稳定性的过程中起关键作用，错配修复基因功能缺失在大肠癌发生机制和诊治研究中起着重要作用，本文就错配修复基因与大肠癌相关性的研究进展作一综述。

错配修复基因；微卫星不稳定；大肠癌

大肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的恶性肿瘤之一。近年来，大肠癌在全球的发病率和死亡率呈明显上升趋势，居全世界癌症发病率的第3位［1］。我国大肠癌发病率居所有癌症的第三位，死亡率居第五位［2］。大肠癌的发生和发展是一个涉及遗传与环境等多因素参与的多阶段、多基因改变的复杂生物学过程，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活以及错配修复基因（mismatch repair，MMR）的突变等等。约85%的结肠癌由染色体不稳定引起，约15%的结肠癌则由DNA错配修复基因缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）所致［3-4］。目前越来越多研究证实错配修复基因的失活在大肠癌的发生中起着重要作用，本文就错配修复基因的生物学特点及与大肠癌的关系做一综述。

一、错配修复基因系统

人类错配修复基因系统是人体细胞中存在的一种能修复DNA碱基错配的安全保障系统（即MMR系统），它是由一系列能特异性识别、双向切除并修复错配碱基的酶分子组成，错配修复基因能特异性地识别和修复DNA复制过程中出现的碱基错配，清除由简单重复序列复制错误而形成的不配对碱基，具有增强复制忠实性，维持基因稳定性，降低自发突变，从而保证DNA复制高度保真性的功能。

人类MMR作用机理是：首先hMSH2与hMSH6形成的hMUtS-α二聚体，结合到非甲基化子链的DNA碱基错配区，在由hMLH1和hPMS2形成的二聚体hMUtL-α协助下，特异性地识别并修复单个错配，插入或缺失的碱基。hMUtS-α和hMUtL-α即可激活与MUTH蛋白有关的GATC核酸内切酶，该酶可切除未修饰的甲基化GATC序列。依赖于hMUtS、hMUtL及DNA解旋酶的协同作用，新生链错配区的一边被切除，整个修复反应被启动。其次，hMUtS-β（hMSH2/ hMSH3蛋白二聚体）在hMUtL-α及hMUtL-β（hMLHl/hPMSl蛋白二聚体）协助下，特异性识别并修复较大片断的插入或缺失［5-6］，这些蛋白复合物一旦检测到碱基错配，就能与有关的酶配合，切除含有错配的DNA片段，并合成新的DNA片段以代替被切除的部分，进而完成错配DNA链的修复过程。已发现人类MMR系统的基因中hMLHl，hMSH2，hMSH3，hMSH6，hPMSl，hPMS2与大肠癌有关的基因，目前研究最多的是hMLH1、hMSH2和hMSH6，hMLH1和hMSH2基因突变占所有检测到的突变的90%以上［7］。MMR缺失会导致DNA链错配的积聚，从而导致微卫星不稳定性。

二、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）

微卫星（Microsatellite）DNA是广泛分布于原核和真核生物基因组中短的串联重复序列，约占人类基因的10%，核心序列为1～6 bp。这类基因多位于基因非编码区以及染色体的近端粒区，在人群中表现为高度多态性主要是由于重复序列长度的数目不同，正常个体体细胞在生长发育过程中其长度（或重复序列的重复次数）保持不变。研究表明，微卫星DNA具有较高的遗传稳定性。

产生MSI的原因可能是由于MMR基因的突变，无法纠正在遗传复制过程中由于DNA“链滑”或在有丝分裂（或减数分裂）期染色体的不对称交换造成的复制错误。MMR功能缺陷的一个重要特征是MSI阳性，与正常细胞相比，MMR缺陷的肿瘤细胞微卫星序列的突变率是正常细胞的100～1 000倍。MMR基因功能缺陷时，不能及时修复DNA复制时的错误，导致癌基因（如癌基因ras，src，e-myc，C-erbB2等）、抑癌基因（APC，p53，DCC等）及其他与肿瘤发生关系密切的基因发生突变累积，而导致肿瘤发生［8］。在多种肿瘤中均可发现MSI，研究较多的为大肠癌，其中大约95%HNPCC和15%的散发性大肠癌中MSI表达阳性。

美国国立癌症研究院（NCI）经广泛讨论推荐采用2个单核昔酸重复序列（BAT-25和BAT-26）和3个二核昔酸重复序列（D-17S25015、D2Sl23和D5S346）5个微卫星位点作为MSI的标准，将大肠癌按微卫星不稳定发生频率分为3型，在分析的5个微卫星DNA标记中有2个或2个以上发生微卫星不稳定现象称为MSI-H；如1个发生微卫星不稳定现象称为MSI-L；如没有发生微卫星不稳定现象称为MSS。MSI的发生与错配修复基因系统缺失密切相关。MSI-H通常称为dMMR，MSI-L、MSS称为pMMR。2008年，Nagasaka等重新定义了MSI，要求至少有1个单核昔酸重复序列不稳定和另外l个NCI推荐的5个微卫星位点中的1个不稳定，他们认为这样可以降低2个二核昔酸重复序列不稳定产生的假阳性［9］。

三、错配修复基因突变与大肠癌

1.MSI引起结直肠癌的分子机制

MSI引发的特殊基因和信号转导途径突变，是导致大肠癌的机制之一。错配修复基因缺失引起微卫星不稳定，微卫星重复序列中30多个基因突变，如DNA修复蛋白MRE11A、hRAD50、转化生长因子β受体Ⅱ、胰岛素样生长因子受体Ⅱ、前凋亡因子Bax、错配修复蛋白MSH3和MSH6等［10］。这些基因在细胞功能及转导途径中发挥多种作用，其突变的急速积聚可诱发大肠癌的发生。遗传性非息肉性结直肠癌与散发性结直肠癌dMMR发生机制不同。

2.MMR与HNPCC

HNPCC又称Lynch综合症，是一种常染色体显性遗传疾病，占全部大肠癌的1%～5%，其特征是发病年龄轻，多小于50岁，有家族史，以右半结肠癌为主，常伴有同时和异时结肠原发癌及结肠外肿瘤。Olschwang等［11］经分析后认为，约70%的HNPCC综合征都是由于MMR基因的胚系突变引起的。其中hMLHl和hMLH2基因的胚系突变是超过90%的HNPCC的致病原因（其中60%HNPCC与hMSH2突变有关，30%与hMLH1突变有关）。在HNPCC中，MMR基因突变失活的机制是一个等位基因在胚系中失活，另一个等位基因由于体细胞的杂和性缺失而失活，最终导致该基因功能完全丧失。基因表型是HNPCC的诊断金标准。79%～93%HNPCC为MSI表型。MSI作为HNPCC的基因标志物作用已在临床中得到认可。由MMR基因变异引起的HNPCC MSI阳性病例随年龄增长逐渐下降，大于50岁患者只有17%MMR基因突变引起男性大肠癌发生率为60%～70%，女性则为30%～40%［12］。该类患者虽然预后较好，5年生存率高于散发性大肠癌，但对放化疗敏感较差。

3.MMR与散发性大肠癌

散发性大肠癌在全部大肠癌中的发病率占80%以上，约15%的散发性结直肠癌存在MSI-H表型［13］。但与HNPCC中MSI发生的机制不同，散发性结直肠癌中，通常发病年龄超过70岁，主要是hMLH1的CpG岛高甲基化表型致dMMR引起，肿瘤抑制基因转录沉默［14］。MLH1沉默占MSI-H病例的95%，hMSH2、hMSH6分别占MSI-H的5%和1%［15］，表现为hMLH1基因的突变率远远高于hMSH2基因的突变率。与MSI-L、MSS相比，MSI-H病例有显著特点，即发病年龄相对年轻、分化高、发病部位为近段结肠、分期早、不易转移，且预后较好［16］。

MMR功能缺陷大肠癌多发生于HNPCC，还发生在少部分MSI-H散发性大肠癌，主要机制为hMLH1基因启动子甲基化导致MMR缺陷。因此，基因启动子甲基化检测、有无家族史有助于鉴别HNPCC及散发性MSI-H大肠癌。已有研究表明BRAF突变与hMLH1甲基化导致的DNA错配修复缺乏相关［14］。Domingo等［17］研究显示，40%散发性MSI-H肿瘤中存在BRAF V600E突变，但是在111例遗传性非息肉性结直肠癌中未检测出该突变。BRAF突变的差异可能会用于鉴别散发MMR功能缺陷结肠癌患者和HNPCC患者。

4.dMMR大肠癌有明显的临床病理特征

分化程度低、较少淋巴结转移、原病灶好发于右半结肠。大量文献报道，伴有dMMR的大肠癌预后较好，MSI-H结肠癌与MSS型结肠癌比较具有独特的临床病理学和分子生物学特征，前者预后较好，在Ⅱ期结肠癌中，未接受化疗的MSIH型结肠癌患者5年生存期高于MSS型结肠癌患者［18-19］。孟文建等［20］对128例散发性直肠癌患者采用PCR技术检测微卫星状态，与MSI-L和MSS肿瘤相比，大多数MSI-H肿瘤患者为女性、黏液腺癌、高分化和术前血癌胚抗原水平高。MSI-H肿瘤患者预后好于MSI-L/MSS肿瘤患者，但差异无统计学意义。有学者研究认为，MSI肠癌肿物较大、浸润较深、局部复发可能大，而远处及重要器官转移发生率低，医生应该注意局部浸润深的遗传或散发dMMR肠癌往往可提示患者预后［21］。dMMR是大肠癌预后良好的一项重要标志，尤其是在HNPCC的预后中更明显［22］。

四、MMR功能缺陷检测在大肠癌预防及治疗中的价值

具有大肠癌家族史的人员患大肠癌的风险较高，在这些家族人员中进行MMR基因突变或功能缺陷的筛查，有利于及时干预，降低患病的风险，早期发现、治疗肿瘤，可望降低病死率、提高生存率。2011年美国NCCN指南推荐对考虑使用氟尿嘧啶单药治疗的Ⅱ期患者进行MMR检测。Ⅱ期结肠癌dMMR患者可能预后较好，单用氟尿嘧啶可能有害。对＜50岁的结肠癌患者，应该考虑行MMR基因检测。Ⅱ期MSIH结肠癌患者预后好，但5-FU为主的辅助化疗不能使其受益。

Des Guetz等针对7项研究进行meta分析认为，对dMMR患者术后给予5-FU辅助化疗不能改善患者的无复发生存率（DFS），术后5-FU辅助治疗获益人群为pMMR患者［23］。Sargent等［24］研究表明，dMMR对未进行化疗的结肠癌患者来说是个预后良好的标志，但dMMR大肠癌（包括HNPCC和约15%的散发性大肠癌，表现为MSI-H和相应MMR蛋白免疫组织化学缺失）对以5-FU为基础的辅助化疗无效，因此推荐对Ⅱ期和Ⅲ期的大肠癌患者进行MMR状态检测，dMMR大肠癌（尤其是Ⅱ期大肠癌）不推荐接受以5-FU为基础的辅助化疗。Zaanan等回顾性分析比较了109名接受5-FU术后辅助和124名接受FOLFOX术后辅助的Ⅲ期结肠癌患者，发现与5-FU术后辅助治疗dMMR患者相比，FOLFOX术后治疗可显著改善患者的DFS，3年DFS分别为57.9%和100%［25］。随后，Zaanan等又分析303名Ⅲ期并且术后均接受FOLFOX4辅助化疗患者的MMR状态，发现与pMMR患者相比，dMMR患者的3年DFS更高，分别为90.5%和73.8%［26］。Bertagnolli等［27］作了同样的研究，Ⅲ期MSI结肠癌接受伊立替康和5-FU辅助化疗效果比MSS结肠癌患者好。因此采用其他药物与5-FU进行辅助化疗时，可能会导致不同的MSI化疗药物预测价值。总之，MSI可作为5-FU化疗药物不敏感性的预测分子标志物，MMR检测对大肠癌（特别是Ⅱ期大肠癌）的个体化治疗有重要的指导意义。在5-FU基础上再联用其他化疗药物，可能会改变MSI对5-FU为基础化疗的无效预测，仍然需要进一步研究［28］。

五、问题与展望

随着分子生物实验技术的提高，MMR的基因检测相对简单、方便，准确率高。MMR在大肠癌发生、发展中起重要作用，对大肠癌的预防、早期诊断及治疗有重要指导意义。但是，尚有很多问题有待解决：①MMR缺陷影响细胞凋亡的信号转导与机制目前尚不明确；②MMR系统与抑癌基因、癌基因之间的相互关系有待进一步研究；③对大肠癌的癌前基因的检测尚未普及，且对大肠癌的预后没有跟踪检测，因此建立完善且方便的检测方法十分必要；④随着对dMMR研究的深人，有可能将大肠癌分为dMMR和pMMR两类而采取完全不同的治疗策略深入研究，以便找出最适合dMMR患者的化疗方案，在规范化治疗的基础上制定个体化治疗方案。

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2014-10-01）

（本文编辑：梁卫江）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.056

510120广州中医药大学第二附属医院

王静，E-mail：drwangjingxj@163.com

广东省科技计划项目（2012B031800202）