HPLC测定葛根温胆颗粒中葛根素的含量

赖杰仁

（九江市中医医院，江西 九江 332000）

HPLC测定葛根温胆颗粒中葛根素的含量

赖杰仁

（九江市中医医院，江西 九江 332000）

目的：建立葛根温胆颗粒中葛根素的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，Prontosil 120-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-0.2%磷酸（18∶82）；流速1.0 m L/m in；检测波长250 nm；柱温30℃；进样量10μL。理论板数按葛根素峰计算应不得低于3 000。结果：葛根素对照品进样量在0.020 02～1.000 84μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），葛根素平均加样回收率为97.45%，RSD为1.62%（n=6）。结论：本方法操作简便，准确可靠，专属性强，重现性好。适宜用于测定葛根温胆颗粒中葛根素的含量。

葛根温胆颗粒；葛根素；含量测定；高效液相色谱法

葛根温胆颗粒系九江市中医医院自主研发的国家重点专科骨病科特色医院制剂，已取得医疗机构制剂批准文号。本品由葛根、当归、桂枝、丹参、红花、威灵仙等十余味中药组成，具有活血通络，化痰散瘀，祛风理气的功效，临床应用于证属痰湿阻络及气滞血瘀型颈椎病，安全可靠，疗效显著。基于葛根素是该复方制剂中主要的指标性成分，本文采用高效液相色谱法（HPLC）测定本品葛根素的含量，将葛根素的含量作为葛根温胆颗粒的质量评价指标，旨在为本制剂建立内控标准。

1 仪器与药品

高效液相色谱仪：Waters系列高效液相色谱仪，包括：Waters 600 controller,PDA2996型二极管阵列检测器，Empower化学工作站。SHIMADZULC-2010AHT高效液相色谱仪，紫外可变波长检测器，LC-solution色谱工作站。KQ5200B型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

葛根素对照品（含量测定用，纯度为 95.5%，批号：110752-201313，中国药品生物制品检定所），甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

葛根温胆颗粒（批号：20131101，20131102，20131103，20131104，20131105，20131106，20131201，20131202，20131203，20131204，九江市中医医院研制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Prontosil120-5-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（18∶82）；流速：1.0 m L/min；检测波长：250 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。理论板数按葛根素峰计算应不得低于3 000。

2.2 检测波长的确定

用PDA检测器对葛根素对照品与样品溶液中与葛根素对照品相应位置上的色谱峰在400～210 nm波长范围内进行光谱扫描，结果均在250 nm波长附近处有最大吸收，故确定检测波长为250 nm。

2.3 样品溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品10.48 mg，置50 m L量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品母液。精密移取对照品母液5 m L，用甲醇定容至50 m L容量瓶中，即得葛根素对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 装量差异项下本品适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 m L，密塞，称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz）30分钟，取出，放冷，再称定质量，用流动相补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性对照样品溶液的制备 除葛根以外，其余各药材按葛根温胆颗粒处方量制备阴性对照样品，同供试品溶液制备方法，制得缺葛根的阴性对照样品溶液。

2.4 方法的专属性试验

分别精密吸取供试品溶液、阴性对照样品溶液与对照品溶液各 10μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定。结果显示葛根素峰形良好，基线平稳，对照品、供试品在相同时间有一色谱峰，而阴性对照样品无干扰，见图1。

2.5 线性关系考察

分别吸取“2.3.1”项下葛根素对照品溶液1，5，10，20μL，对照品母液5μL，注入液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件测定葛根素峰面积，以进样量X与峰面积Y线性回归处理，在0.020 02～1.000 84μg范围内葛根素进样量与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），回归方程为：

Y=4.589 84 ×106X-4.339 84×103。

n=5，见图2。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.3.1”项下葛根素对照品溶液10μL，按“2.1”项下色谱条件，测定葛根素峰面积值，重复进样测定6次，计算得对照品峰面积值相对标准差为0.57%，测定方法的精密度良好。

图1 葛根素色谱图

图2 葛根素的线性图

2.7 稳定性试验

按“2.1”项下色谱条件，分别在 0，1，3，5，7，9，12，24小时，精密吸取照“2.3.2”项下制备的供试品（批号：20131201）溶液10μL，测定供试品溶液中葛根素峰面积值，计算供试品葛根素峰面积值的相对标准差为0.79%，表明供试品溶液在24小时内基本稳定。

2.8 重复性试验

装量差异项下本品（批号：20131201）适量，研细，取约0.5 g，共6份，精密称定，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，处理结果数据，平均含量为2.149 5 mg/g，RSD为1.00%，方法重现性良好。

2.9 加样回收率试验

装量差异项下本品（批号：20131201，葛根素含量为2.149 5mg/g），研细，取6份，每份约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入含葛根素 （浓度0.010 01 mg/m L）对照品的流动相混合溶液50.00 m L，称定质量，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，见表1。样品中葛根素平均回收率为97.45%，RSD为 1.62%（n=6），葛根素回收率良好。

表1 葛根素回收率测定结果

2.10 耐用性试验

装量差异项下本品（批号：20131201，20131202），研细，取约0.5 g，精密称定，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，分别用A：Prontosil120-5-C18（250mm× 4.6mm，5μm)，B：Agilent Eclipse XDB-C18（250mm× 4.6 mm，5μm)，C：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）3种品牌的色谱柱，按“2.1”项下色谱条件测定葛根素含量，葛根素含量的RSD低于1.0%，见表2。

2.11 样品测定

表2 不同色谱柱测定葛根素含量结果

装量差异项下本品10批次，研细，各取约0.5 g，精密称定，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算葛根素含量,见表3。葛根素含量在1.720 5～ 2.162 5 mg/g，10批次本品葛根素平均含量为1.885 8 mg/g。根据表3测定结果，考虑药材来源、配制操作等因素的差异影响，以平均含量的80%划作葛根温胆颗粒中葛根素含量的限度，即规定：本品每1 g含葛根以葛根素（C21H20O9）计，不得少于1.5 mg。

表3 葛根温胆颗粒中葛根素含量

3 讨论

3.1 流动相的选择

方法学研究实验中，分别比较了以甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.1%醋酸为流动相，考察葛根温胆颗粒中葛根素的分离情况及峰形，结果以甲醇-0.2%磷酸溶液（18∶82）为流动相的分离情况及峰形为佳；故确定流动相为：甲醇-0.2%磷酸溶液（18∶82）。3.2供试品溶液制备的方法考察

在供试品溶液的制备方法实验中，分别考察了以流动相加热回流提取 30 min，超声提取（功率300 W，频率25 kHz）30 m in两种提取方式，结果显示，这两种提取方式对含量测定结果差异不明显，而超声处理较简便易行，故选用超声处理提取方式制备供试品溶液。分别选择了流动相、甲醇、乙醇为提取溶剂，考察提取溶剂对含量测定结果的影响，结果以流动相提取效果最好。分别超声提取 20，30，60 m in，考察结果显示，超声提取30 m in即可得满意结果。

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Content Determ ination of Puerarin in Gegen W endan Granules by HPLC

Lai Jieren（Traditional Chinese Medicine Hospital of Jiujiang City，Jiangxi Jiujiang 332000，China）

Objective:To establish a HPLC method for the content determination of puerarin in gegen wendan granules.Methods:Samples were determ ined by HPLC on the C18column（250 mm ×4.6 mm，5μm）.The column temperature was at 30℃；the inject volume was 10μL.The mobile phase was consisted of methanol-0.2% phosphoric acid （18∶82）.The flow rate was 1.0 m L/min at UV detection wavelength of 250 nm.The number of theoretical plate calculated by puerarin peak should be not less than 3 000.Results:There was a good linear relationship of puerarin w ithin the range of 0.020 02～ 1.000 84μg，r=0.999 9.The average recovery of puerarin was 97.45%，RSD=1.62% （n=6）.Conclusion:The method is convenient and accurate w ith a good specificity and reproducibility， it is suitable for the content determ ination of puerarin in gegen wendan granules.

Gegen Wendan Granules；Puerarin；Determination；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.07.004

2015-04-08）

赖杰仁，男，硕士，高级工程师。研究方向：中药新制剂与新技术。E-mail：smz_lai@163.com