克霉唑栓微生物限度检查方法的验证

张亚茹，陈莉莉，曹佳茜，赵肖肖



克霉唑栓微生物限度检查方法的验证

张亚茹，陈莉莉，曹佳茜，赵肖肖

目的 探讨克霉唑栓微生物限度方法学验证。方法采用45 ℃ 1%吐温80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备供试液，采用薄膜过滤法。结果各菌的回收率达到70%以上。结论该方法适合不同基质的克霉唑栓微生物限度方法检查。

克霉唑；微生物限度检查；方法验证

0 引言

克霉唑为广谱抗真菌药，对多种真菌，尤其是白色念珠菌有较强的抗菌作用。其作用机制是抑制真菌细胞膜的合成，以及影响其代谢过程。而克霉唑栓由于剂型特点，及其基质的影响，更使其抑菌活性成分很难去除，回收率很难达到要求。故从供试液的制备、取样量、冲洗液的体积、滤膜的选用等方面进行了考察。以适当的方法消除制剂中抗微生物物质的活性后，才能进行其微生物限度的检查。本文对克霉唑栓微生物限度检查方法进行试验研究，以确定该药物所用微生物限度检查方法的有效可行。

1 仪器与材料

1.1 样品名称及来源 克霉唑栓(批号：131004，上海现代制药股份有限公司)；克霉唑栓(批号：140401，武汉中联药业集团四药药业有限公司)；克霉唑栓(批号：130403，马应龙药业集团有限公司)；克霉唑栓(批号：20140402，哈尔滨欧替药业有限公司)。

1.2 实验用品

1.2.1 验证用菌种 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]，以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。

1.2.2 培养基 胆盐乳糖培养基，批号：130902；改良马丁琼脂培养基，批号：121122；营养琼脂培养基，批号：1309272；pH 7.0氯化钠-蛋白胨溶液，批号：1211262；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：1312182；营养肉汤培养基，批号：121218；沙氏葡萄糖液体培养基，批号：1302252；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号：1309022；甘露醇氯化钠琼脂培养基，批号：1107112；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，批号：110928。以上培养基均由北京三药科技开发公司提供。

1.2.3 仪器设备 32 ℃电热恒温培养箱：DNP-9272型，上海精宏实验设备有限公司；25 ℃霉菌培养箱：MJP-150型，上海精宏实验设备有限公司；HQM.C型立式灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司；电子天平：PL2002型梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；水浴恒温振荡器：SHA-C型，江苏省金坛市宏华仪器厂；数显恒温水浴：HH-6型，常州国华电器有限公司。

1.2.4 微孔滤膜 A.材质：尼龙，尺寸：直径50 mm，性状：亲水性，孔径：0.45 μm，厂家：杭州泰林生物技术设备有限公司。B.材质：混合纤维素酯，尺寸：直径47 mm，性状：亲水性，孔径：0.45 μm，厂家：杭州泰林生物技术设备有限公司。C.进口CAT.NO:HVWP047S6 LOT.NO:F2PA66030 QTY:150PK，10元/膜。

2 验证方法

2.1 验证依据 《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J微生物限度检查法[1]。

2.2 菌液制备

2.2.1 取经32 ℃培养24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的营养琼脂斜面培养物适量，加入到0.9%无菌氯化钠溶液中，与标准比浊液浊度相当，作为原液；取原液倍量稀释至细菌数约为50～100 cfu/mL，备用。

2.2.2 取经25 ℃培养48 h的白色念珠菌改良马丁琼脂斜面培养物适量，加入到0.9%无菌氯化钠溶液中，与标准比浊液浊度相当，作为原液；取原液倍量稀释至酵母菌数约为50～100 cfu/mL，备用。

2.2.3 取经25 ℃培养7 d的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加5 mL含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，取出霉菌孢子悬液倍量稀释至霉菌数约为50～100 cfu/mL，备用。

2.3 供试液制备 称取供试品10g，加45 ℃1%吐温80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，置恒温振荡器中震荡使溶解，稍放置，取清液(无渣)作为1∶10的供试液，备用。

2.4 菌落计数方法[2]

2.4.1 常规法 取1∶10供试液清液1 mL和50～100 cfu试验菌，分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基。按平皿法测定其菌落数。

2.4.2 培养基稀释法 取1∶10供试液清液1 mL分别注入10个平皿中，同时加入50～100 cfu试验菌，立即倾注琼脂培养基。按平皿法测定其菌落数。

2.4.3 薄膜过滤法 细菌计数：取1∶10供试液的清液1 mL，采用薄膜过滤法，冲洗量500 mL/膜，冲洗液为45 ℃ 1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液，最后一次冲洗液中加入50～100 cfu试验菌。霉菌酵母菌计数：取1∶10供试液的清液1、0.5 mL，采用薄膜过滤法，冲洗量1 000 mL/膜，冲洗液为45 ℃ 1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液，最后一次冲洗液中加入50～100 cfu试验菌。

2.5 回收率测定 试验组：分别按上述菌落计数方法进行试验组的菌落计数。计算供试液的平均菌落数。菌液组：测定每一株菌的试验菌数。供试液对照组：取供试液1 mL，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。稀释剂对照组：取稀释剂1 mL和50～100 cfu试验菌，按试验组菌数测定方法测定其菌数。

2.6 控制菌检查方法的验证[3-4]

2.6.1 白色念珠菌(薄膜过滤法)试验组：取1∶10供试液的清液10、5、2 mL，采用薄膜过滤法，冲洗量1 000 mL/膜，冲洗液为45 ℃ 1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液，取膜放入100 mL沙氏葡萄糖液体培养基中，加入10～100 cfu试验菌，25 ℃培养48～72 h，取上述培养物，划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48 h，必要时可延长至72 h。结果：按上述方法，10、5 mL未检出试验菌，2 mL检出试验菌，故此方法供试液取样量2 mL可行。

2.6.2 金黄色葡萄球菌(薄膜过滤法)试验组：取1∶10供试液的清液10 mL，采用薄膜过滤法，冲洗量500 mL/膜，冲洗液为45 ℃ 1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液，取膜放入100 mL营养肉汤培养基中，再加入10～100 cfu试验菌，32 ℃培养18～24 h，必要时可延长至48 h，取上述培养物，划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72 h。结果：按上述方法，检出试验菌，方法可行。

2.6.3 铜绿假单胞菌(培养基稀释法)试验组：取1∶10供试液的清液10 mL和10～100 cfu试验菌，加入到200 mL胆盐乳糖培养基中，32 ℃培养18～24 h，取培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24 h。结果：按上述方法，检出试验菌，方法可行。

3 结果

3.1 菌落计数及回收率测定 结果表明，在三次独立的平行试验中，常规法及培养基稀释法回收率达不到要求，见表1、表2。采用薄膜过滤法，取样量1 mL时，白色念珠菌的回收率<70%，而取样量减小到0.5 mL时，白色念珠菌的回收率高于70%，见表3、表4。故细菌、霉菌、酵母菌菌落计数采用薄膜过滤法，但霉菌、酵母菌计数时、取样量减小到0.5 mL进行。

表1 常规法菌落计数及回收率测定结果(cfu)

表2 培养基稀释法菌落计数及回收率测定结果(cfu)

3.2 控制菌检查 结果表明，采用薄膜过滤法和培养基稀释法进行验证，白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌阳性对照菌检出。见表5。

3.3 根据验证试验结果确定克霉唑栓微生物限度检查法

3.3.1 菌落计数 细菌计数可采用薄膜过滤法(1 mL供试液，500 mL冲洗液/膜)检验；霉菌及酵母菌计数可采用薄膜过滤法(0.5 mL供试液，1 000 mL冲洗液/膜)检验。

3.3.2 控制菌检查 白色念珠菌采用薄膜过滤法(2 mL供试液，1 000 mL冲洗液/膜)；金黄色葡萄球菌采用薄膜过滤法(10 mL供试液，500 mL冲洗液/膜)；铜绿假单胞菌(培养基稀释法培养基用量200 mL)检验。

表3 薄膜过滤法(取样量1 mL)菌落计数及回收率测定结果(cfu)

表4 薄膜过滤法(取样量0.5 mL)回收率测定结果(cfu)

表5 控制菌检查结果

4 讨论

4.1 供试液的制备 供试液制备完成后，如果取混悬状态的供试液，白色念珠菌的回收率和控制菌的检验都达不到要求；制备完成后，稍放置，取中间的清液就能达到要求。

4.2 取样量和冲洗液的量的选择 细菌计数取1 mL，冲洗量500 mL/膜回收率就能达到要求；白色念珠菌取样量0.5 mL，冲洗量1 000 mL/膜时，实验菌的回收率才能达到要求。而控制菌只有铜绿假单胞菌可以用培养基稀释法检出阳性菌，白色念珠菌和金黄色葡萄球菌用薄膜过滤法，取样量和冲洗液的量也做了考察，最后确定白色念珠菌取样量2 mL供试液，1 000 mL冲洗液/膜；金黄色葡萄球菌取样量10 mL，500 mL冲洗液/膜。

4.3 微孔滤膜的选择 滤膜的过滤速度A

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:附录107.

[2] 繆玉萍.离心沉淀-培养基稀释法检查克霉唑阴道片微生物限度(细菌)[J].心理医生(下半月版),2012,5:29-30.

[3] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].北京:中国医药科技出版社,2010:351.

[4] 周剑,王刚林.克霉唑阴道片微生物检查方法学研究[J].中国药业,2013,22(22):57-59.

Verification of microbial limit examination for clotrimazole suppositories

ZHANG Ya-ru,CHEN Li-li,CAO Jia-xi,ZHAO Xiao-xiao

(Fuxin Institute for Food and Drug Control,Fuxin 123000,China)

Objective To establish the method of microbial limit examination for clotrimazole suppositories.MethodspH 7.0 sterile buffered sodium chloride-peptone solution with 1% tween-80 at 45 ℃ was used to make test solution.Filtration membrane method was used for the examination.ResultsThe recovery rate was more than 70%.ConclusionThis method is effective and feasible,it could be applied to the microbial limit examination for various matrix of clotrimazole suppositories.

Clotrimazole suppositories; Micro limit examination; Validation of the method

2014-12-02

阜新市药品检验所，辽宁 阜新123000

10.14053/j.cnki.ppcr.201505023